• 资讯

顺行跨突触的病毒工具是神经科学领域中迫切需求的,最新的Neuron 报道了AAV顺行跨突触应用的新突破。Zingg et al.就采用了AAV2/1顺行跨突触示踪。研究结果展示了AAV2/1的顺行跨突触传播能力。实验中,AAV2/1-Cre能有效转导突触前神经元,Cre表达于特定的突触后神经元,延轴突实现顺行标记。作者将AAV2/1应用到上丘(superior colliculus, SC)神经元,操作起始神经元胞核及其下游的二级通路,发现SC神经元可以接受来自听觉和视觉皮层的皮质下丘投射,介导着逃离和冻结两种不同的防御行为。AAV顺行跨突触病毒工具将极大拓展神经科学的研究思路,并得到广泛应用。

枢密部分顺跨单产品:

PT-0001    rAAV-Ef1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA
PT-0009    rAAV-CaMKIIa-eNpHR3.0-mCherry-WPRE-pA
PT-0012    rAAV-Ef1α-DIO-EYFP-WPRE-pA
PT-0013    rAAV-Ef1α-DIO-mCherry-WPRE-pA
PT-0025    rAAV-CMV-Cre-pA
PT-0075    rAAV-Ef1α-DIO-FLP-WPRE-pA
PT-0136    rAAV-hSyn-Cre-WPRE-pA

1. AAV 1型具有较强的顺行跨突触能力

图 1. AAV1顺行跨突触激活环路示意图 (left)和不同血清型的Cre携带的病毒感染SC细胞,阳性标记细胞的定量 (right)结果说明,AAV2/1的顺行跨突触能力显著高于其他血清型(Zingget al.,2017)

 

2. AAV1顺行跨神经元传播的突触特异性表现

图 2. Ai14 小鼠 V1区注射AAV2/1-CMV-Cre,未在胼胝体检测到tdTomato+的胶质细胞,且tdTomato+的神经元胞体GFAP染色呈阴性 (Fig. 4A),提示病毒的传播是高度局限于神经元之间的突触联系的。将AAV2/1-hSyn-Cre和AAV2/1-EF1a-DIO-ChR2-EYFP共注射,结果显示,有TTX和4-AP存在时,全细胞记录确定了ChR2标记的V1区轴突末梢和tdTomato+纹状体神经元之间存在单突触联系。在所有记录的细胞中,在TTX和4-AP存在时,蓝色的LED脉冲激发的兴奋性突触电流能够维持,而抑制性电流则被药物消除 (Fig. 4B)。因为ChR2标记的V1区轴突末梢含有Cre病毒,其与跨神经元标记的纹状体神经元之间的功能偶联,有力证实了携带Cre的AAV1可以跨突触传播 (Zingg et al., 2017)。

Reference
Neuron. 2017 Jan 4;93(1):33-47. PMID:27989459
Doi: 10.1016/j.neuron.2016.11.045.“AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors”

 

 

rAAV/Retro正式上线啦,快来从神经末梢点亮吧!

枢密科技研发团队参照2016年9月份Neuron报道的D.Gowanlock R.Tervo等人的工作。现已成功构建包装出能有效应用于目前实验研究的rAAV/Retro工具病毒。

现货产品

PT-0012  rAAV-Ef1α-DIO-EYFP-WPRE-pA

PT-0075  rAAV-Ef1α-DIO-FLP-WPRE-pA

PT-0098  rAAV-Ef1α-EYFP-WPRE-pA
更多产品生产中,亦可根据您的需求定制,欢迎咨询。

rAAV/Retro 部分测试结果:注射位点VTA,逆向投射可以在LH、AIP、M1/2、ACC等位点观察到信号(图片来自枢密科技 )

在D.Gowanlock R.Rervo的工作之前,经典的血清型对于神经元投射的逆向标记存在各种缺陷,不能满足各种科学研究的需求。rAAV/Retro有广阔的应用前景。首先是逆行标记效率高:较经典血清型提高了100倍以上,甚至可以达到染料和Retrobead类似的逆标效率。其次是应用广泛:1.rAAV/Retro 可以轻松表达出所携带的目的基因,做以往很难实现的各种操纵;2.临床的应运中也有巨大潜力,可以与其他的神经示踪病毒结合使用,特异、有目的解析神经环路问题,针对性地进行神经元群的基因编辑等多样性的基因治疗。


图注:特异标记皮层第五神经元的转基因CRE小鼠(Rbp4_KL100Cre)脑桥基底核定位注射rAAV-Retro-DIO-CAG-tdtomato和rAAV-CAG-EGFP病毒。rAAV-Retro-DIO-CAG-tdtomato病毒逆向感染投射至注射位点的皮层第五层Cre阳性投射神经元细胞,从而使皮层-脑桥基底核投射表达红色荧光;rAAV-CAG-EGFP病毒感染注射位点的基地核的神经细胞胞体,进而使基地脑桥核-小脑投射表达绿色荧光。(图片来自参考文献)

参考文献:

Neuron. 2016 Oct 19;92(2):372-382 PMID:27720486 DOI:10.1016/j.neuron.2016.09.021 A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.

助力科研---高纯度滴度病毒开启非人灵长类科研之路

导读:

非人灵长类(Nonhuman Primate,NHP)动物是研究脑的结构与功能、各种脑疾病的病理及治疗的主要模型之一。特别是在理解人类所具有的感觉、运动和高级认知功能的神经机制方面,有着不可替代的作用。其脑结构和功能的解析也是中国脑科学计划的焦点。现阶段,病毒载体在NHP脑结构和功能解析中扮演者非常重要的作用。如利用病毒做神经环路示踪、光遗传、钙成像、药理学、磁遗传学研究,也可以进行基因编辑、干扰、过表达等。NHP具有较强免疫能力,给病毒工具的应用带来了挑战。只有保证病毒具有高纯度和高滴度,才能实现较好的效果。

枢密科技提供包括光遗传学,药理学,钙成像,基因编辑,基因治疗在内的一系列满足灵长类注射的高滴度高纯度病毒工具。

正文

一直以来,非人灵长类动物被认为是与人类脑功能结构最接近的物种,可用于研究在灵长类所特有的脑结构和功能及演化机制,是解析人类高级认知功能的神经环路结构和工作原理、进行脑重大疾病的机理和诊断干预手段的研发,甚至宏观脑图谱绘制非常必要的实验模型。

病毒工具推动灵长类研究的多样化开展

各种脑科学技术的不断革新和涌现为脑科学研究带来更发展前景。包括基因编辑及干细胞技术、遗传学标记与神经环路示踪技术、透明脑与快速光学成像、fMOST及单细胞转录组技术等。其中,以CRISPR/Cas 9为代表的新基因编辑工具,使得NHP动物的遗传操作愈加容易。新的转基因NHP动物和灵长类脑疾病模型不断涌现。而实现精确的基因修饰,较为依赖于转基因动物操作平台,Knock-in/Knock-out的效率及周期仍然限制NHP动物在更多实验室的应用。基于各类病毒工具发展的编辑及示踪技术,能够在出生后的各个阶段,研究生理及病理状态下。在体操作NHP动物,从分子到细胞,从环路到行为,解析基因-表型关联,探索脑疾病的致病机制,并在此基础上寻求新的有效的治疗策略。

何时使用NHP模型 [Ref 1]
NHP与啮齿类的大脑在生理物理结构(脑容量,细胞类型和细胞数目),基因表达及功能行使都存在差异,在进行如下研究时应考虑使用NHP模型。

1. 研究高级认知功能:由前额叶控制的高级认知功能相关的临床症状,致病基因在NHP和啮齿类动物的表达有差异,在啮齿类动物上难以模型等同化;
2. 研究社会行为学:尤其是精神类疾病,NHP和啮齿类的行为表现差异很大。与精神疾病风险发生相关的遗传变异,如细胞特异性启动子、增强子、内含子、非编码RNA也是显著不同的;调节行为的物质,如神经肽催产素仍需要在NHP动物中进行详尽的评估;
3. 研究CNS疾病相关的药物:包括发育相关,神经性的和精神疾病。以神经肽催产素和α-7烟碱型乙酰胆碱受体为例,其在啮齿类和NHP中分布是不同的。经啮齿类动物测试有效的药物在临床试验的效果常不尽如人意。临床前增加NHP实验有助于降低临床试验的风险;
4. 研究发育及前驱症状相关的疾病:人的大脑发育比啮齿类动物慢得多,经历相当长的幼龄阶段,这一时期的经验学习急剧地塑造脑部的结构和功能,NHP模型显然是更接近人类的。

人类疾病NHP模型 [Ref 1]
在NHP动物里再现人的疾病,对某个基因操作之前,应对基因-表型关联和致病机制有所预期,即现有的技术能够在何种程度上实现模型的构建,相应的疾病表型如何判断,如何保证重复性?

1. 易造模疾病:单个等位基因突变即有致病表型,如单倍剂量不足(Shank3和自闭症),或者是X染色体连锁的(FMRP、MECP2、DMD)。这些靶点的另一个显著特征则是病人有早期发育缺陷,可在较早阶段观察NHP遗传模型。
2. 难成模疾病:功能获得性突变和部分功能缺失的突变不容易操作,多数需要基因敲入,通过同源重组精确改变基因内部序列。典型的例子包括亨廷顿症,肌萎缩性脊髓侧索硬化症,阿尔茨海默症。
3. 多基因疾病模型:此类疾病的发生涉及到多个基因,单个基因的影响及表型并不十分显著,表现出遗传学和临床异质性。如常见的精神分裂症和双相障碍,因其影响的是认知功能,难以在啮齿类动物上造模。此类疾病的模型化在技术上面临挑战。

小结

研究人员越来越多将注意力转向NHP转基因动物和疾病模型的开发上。与此同时,国际上针对动物福利的法规也越来越严苛。因此,不同机构多方合作开展NHP实验克服技术瓶颈,尽可能充分地利用非人灵长类动物资源,助力人类脑疾病研究。

 

病毒测试效果图

Figure 1. Expression of rAAV-CamkII-mCherry-WPRE-pA. 注射位点:额叶(弓状沟后方,FEF区);滴度:(1E+13 vg/ml)。

Figure 2. Expression of rAAV-hSyn-mCherry-WPRE-pA.  注射位点:视皮层(V1);滴度:(2E+12 vg/ml)。

结论:

由上图可知,注射的病毒由注射位点感染,进入胞体后沿轴突运输到特定区域。结果表明,病毒均匀分布于所标记的脑区,同时,病毒携带的外源基因可以在靶细胞内高效表达。AAV9可通过皮层-纹状体途径进行双向运输,在神经系统性疾病如阿尔茨海默症和亨廷顿症等的基因治疗中显示着巨大的应用前景[Ref 2]

References
[1] Nat Neurosci. 2016 Aug 26;19(9):1123-30. doi: 10.1038/nn.4362.Opportunities and challenges in modeling human brain disorders in transgenic primates.
[2] Gene Ther. 2016 Jun;23(6):520-6. doi: 10.1038/gt.2016.24. Axonal transport of AAV9 in nonhuman primate brain.

血脑屏障直通车:枢密病毒PHPB开车了!

枢密研发团队参考Deverman et al的工作,经过不懈努力,历时半年,成功攻关,推出穿越BBB的AAV-PHP.B,测试结果见文末。

 

导读:

近来,关于血脑屏障blood–brain barrier (BBB)/神经血管单元( Neurova-scular Unit, NVU )的研究不断增长,以便找到更好的方法地将治疗性分子有效地投递到大脑中。常规的方法是将基因载体通过立体定位手术直接注射入脑内,其弊端是基因扩散范围小,且难以控制; 另外,侵入性的方法不利于基因治疗在人体中的应用。如何利用非侵入性的方法,即通过静脉注射将基因药物转运入中枢神经系统内,是基因治疗领域的一个难点。目前,随着基因治疗载体的开发和应用,脑内非侵入性基因治疗的研究已取得了一定的进展。

正文

大脑的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)为CNS提供了强有力的保护,但也使得药物和其他分子的递送变得极为困难。 2016来自Caltech的科学家基于Cre重组的AAV靶向进化(Cre recombination–based AAV targeted evolution, CREATE)的病毒衣壳选择方法,筛选出可以转导体内表达Cre的细胞群体的AAV病毒衣壳变异体,其中一种变异体病毒是AAV-PHP.B,经静脉注射后能够高效地和广泛地转导成年小鼠中枢神经系统。

为什么是PHP

该论文的多名作者,包括通讯作者Viviana Gradinaru (CLARITY技术的发明人之一)都曾在该校另一位已逝的神经科学家Paul H. Patterson实验室接受训练,而这一工作的开展也始于Dr. Patterson的实验室。于是,经CREATE (Cre recombinase-based AAV Targeted Evolution)得到的病毒变种命名为AAV-PHP。

Figure 1. CREATE筛选策略赋予AAV-PHP.B穿越能力。

AAV-PHP.B往哪里去

AAV-PHP.B经尾静脉注射,随着血流一路跋涉,成功穿越了BBB的脉管系统。感染后表现出以下特点:AAV-PHP.B可高效转导CNS的多数细胞,星形胶质细胞,少突胶质细胞和神经元;相比AAV-9(Control),AAV-PHP.B对中枢神经系统的感染效率至少高出40倍。

Figure 2. 注射后PHP血清型的AAV很快定位到脑内的脉管,AAV-PHP.B特异地高效标记CNS,对外周器官嗜性显著降低。感染后3周可在皮层、纹状体、脊髓、视网膜、丘脑和小脑观察到GFP的高效表达(Fig. 2a-e,g),对胰腺和肾上腺的标记较AAV9少,对肝脏、心脏、肌肉和肾脏无差别(Fig. 2f-g)。

枢密的测试结果:

图注:尾静脉注射PHP.B血清型的rAAV-hSyn-mCherry-WPRE-pA,可看到病毒可有效跨越血脑屏障,高效标记小鼠大脑中枢神经系统。图A所示为小鼠脑矢状切片,图B、C和D为A虚线框的放大图。

部分现货产品列表如下,更多产品及其测试结果,欢迎咨询交流。

AAVPHPB-100      rAAV-hSyn-mCherry-WPRE-pA
AAVPHPB-107    rAAV-CaMKIIa-EGFP-WPRE-pA

References:

[1]. Nature Biotechnology 34, 204–209(2016)doi:10.1038/nbt.3440
Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.
[2]. http://www.caltech.edu/news/delivering-genes-across-blood-brain-barrier-49679

 

【GFAP】星胶也点亮了!

星形胶质细胞(astrocytes)在神经系统的发育和调控中发挥着独特的作用。近期的研究表明星形胶质细胞与各种疾病的形成有一定关联,或可成为神经系统相关疾病治疗的新靶点。与其相关的特异性启动子(如GFAP),也会在神经系统疾病的治疗中得到更广泛的应用。

正文:

星形胶质细胞在CNS中扮演着多种角色,如大脑正常发育,离子、神经递质、水和能量平衡,信号调控等,将大脑灰质划分为包括血管,神经元和突触在内的多个功能域(domain)。单个的星形胶质细胞可以通过其domain协调多达2,000,000个突触。在成体大脑中,星形胶质细胞也充当着神经祖细胞,不断产生新的星形胶质细胞和神经元。不论是在生理状态还是在病理状态,星形胶质细胞都极为活跃。


 不同激活程度的actrocyte在CNS中的功能。图片来自 [Ref 1]

1. GFAP在星形胶质细胞里表达

胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是特异性表达在成熟星形胶质细胞的中间丝蛋白。但是,并不是所有的astrocyte都是GFAP阳性的,且astrocyte可表达10种不同形式的GFAP。GFAP作为标志marker之一,用于研究早期神经干祖细胞的发育和谱系追踪。哺乳动物脑中GFAP 阳性细胞在胚胎发育期及出生后的特定脑区均能够分化为多种类型的胶质细胞和神经元。值得注意的是,有时astrocyte标记的特异性会出现丢失。在某些类型的星形胶质细胞瘤细胞中,GFAP表达下降甚至不表达。病理条件下(如中风和神经创伤),GFAP在组织受损处其活性会上调。另一个蛋白,ALDH1L1同样用来标记astrocyte,且ALDH1L1在脊髓的表达随年龄增加降低。

2. GFAP启动子在病毒载体中广泛应用

病毒是向成体动物和发育中的大脑投递外源基因的有效工具。GFAP 启动子能够驱动效应基因在星形胶质细胞中特异性地长时表达,并被广泛用于动物实验。当其用于AAV和LV等病毒载体时需要考虑以下问题:1)组织交叉性,即病毒载体的组织和细胞嗜性;2)反向末端重复序列ITRs的转录元件的影响。含GFAP启动子的AAV2在脊髓和海马神经元内亦有表达,这种广泛的非特异性表达可能与病毒本身对神经元的嗜性有关。含GFAP启动子的LV转导含神经元和astrocyte的小鼠大脑皮层培养物,目的基因在astrocyte内特异表达。但是,体内实验中同样观察到了神经元的标记。

3. GFAP启动子用于基因治疗

要实现对神经系统疾病的基因治疗,需要所投递的基因在特定部位长时程稳定表达。为了更加精细地调控目的基因在靶器官/靶细胞内的表达,通常对启动子进行改造以增加转录和表达活性,获得功能较强的神经组织和细胞特异性启动子,甚至是疾病特异性启动子,且能够在多种病毒载体上使用。GFAP启动子的特异性和活性已得到广泛的验证,已有多项研究采用GFAP启动子驱动治疗性基因的表达,如 (TGF)-β1、BDNF、BAX、PDGFB等。AAV是基因治疗的常用工具之一,受到包装容量限制,使用AAV向特定神经细胞投递外源基因时,需要搭载紧凑型启动子。有报道显示,2.2 kb长的人源GFAP启动子在整个CNS的astrocyte都有表达,修饰的截断形式则可以只在特定区域表现活性,或者在astrocyte和神经元内都表达。随着人们对astrocyte功能认识的逐步加深,GFAP启动子将会得到更广泛的使用。

枢密的测试效果图:

实验说明:本次测试病毒为PT-217:rAAV-GFAP-EYFP-WPRE-pA (AAV9)。

注射位点:S1BF

注射滴度:2.83E+12 vg/ml;剂量:300 nl/只。
病毒注射3 w后,灌流取脑,冰冻切片,GFAP免疫组化后Confocal成像。

实验结果:

结果显示,病毒在注射位点S1BF荧光蛋白表达较强,与星形胶质细胞标记物GFAP共标率较高。此处的启动子为人源parental 2.2 kb,其他长度的截断形式(1kb及小于1 kb),欢迎咨询。

部分GFAP产品现货列表如下:

PT-229    rAAV-GFAP-EYFP-WPRE-pA-U6-shRNA
PT-217    rAAV-GFAP-EYFP-WPRE-pA
PT-209    rAAV-GFAP-CRE-WPRE-pA

枢密提供以下神经特异启动子,更多未列出测试中在研启动子,欢迎咨询交流。

 

References
[1]. Acta Neuropathol. 2010 Jan;119(1):7-35. doi: 10.1007/s00401-009-0619-8.
Astrocytes: biology and pathology.
[2]. Curr Opin Cell Biol. 2015 Feb;32:121-30. doi: 10.1016/j.ceb.2015.02.004.
Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system.
[3]. Oncol Lett. 2013 Feb; 5(2): 669–674. doi:10.3892/ol.2012.1055.
The glial fibrillary acidic protein promoter directs sodium/iodide symporter gene expression for radioiodine therapy of malignant glioma.
[4]. Glia. 2008 Apr;56(5):481-93. doi: 10.1002/glia.20622.
GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.

[AAV滴度] 活体注射需回避滴度虚高!

不同的实验,对病毒注射滴度要求有差异。虚高的病毒滴度以及普遍的可能超出实验需求的高滴度注射,已经给一些实验的开展带来困扰。病毒的真实滴度是开展后续实验的关键参数,下文以AAV相关实验列举与此相关的两个问题:1)病毒滴度的检测;2)实验中病毒注射滴度的确定。

1. 滴度检测:

1)枢密采用的定量工艺,已极大程度避免了使用ITR定量产生的虚高滴度,能够较好地反映真实的病毒量。虚高的病毒滴度会导致实验难以开展,无法观察到实验现象,不能够重复。
2)AAV的滴度,给出的结果是检测到的基因组拷贝数,反映的是病毒颗粒数,单位是vg/mL,即vector genomes/mL。

2. 病毒注射:

1)    病毒注射前调整至合适的工作浓度。
2)  AAV中枢注射?
答:注射体积与核团的大小有关,一般在200-300 nL,滴度在10^12 数量级即可。用量根据随基因片段大小,启动子活性高低,表达丰度而适当调整。对大核团的侵染,则需要考虑多位点注射及大体积注射。
3) AAV外周注射?
答:请根据实验查阅文献或就产品咨询我们的销售和技术支持。
4) AAV感染小鼠后多久可以观察结果?
答:一般,2-3周可检测到较强的信号表达(胞体和纤维均可见)。部分产品,在7-14天就能观察到很好的表达。
5) AAV外源基因表达时长?
答:6个月以上,在小鼠大脑中可持续两年以上。活体组织中外源基因的表达量和表达曲线,受到具体实验条件,小鼠免疫清除强度,细胞增殖特性,病毒携载基因特性等多个因素影响。

3. 哪些实验需要高滴度注射:

1)小鼠和大鼠的病毒使用:一般,建议将注射滴度控制在≤ 5 x 10^12 vg/mL范围。
2)非人灵长类使用:对于此类动物的注射,需要注射高滴度,10^13 vg/mL数量级的病毒。
3)特定类别的病毒产品:如rAAV/Retro系列、1 型AAV顺跨单系列。这两类AAV均需要高滴度注射。我们的实验发现,这两类病毒能够携载的功能探针和基因有各自的适用范围,可咨询我们的销售和技术支持。