【招商】武汉枢密脑科学技术有限公司

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枢密科技简介

枢密科技是病毒载体开发与制备技术的国家级高新技术企业,为神经、血液、肿瘤、代谢等领域提供基础及转化医学研究病毒工具和技术服务;为罕见病基因治疗溶瘤病毒肿瘤免疫细胞治疗神经系统药物开发等领域提供病毒载体改造大规模制备药物开发药效评估服务。

枢密科技由科学院脑科学卓越中心病毒学专家、神经科学专家于2014年成立,四年来服务全国高校、医院、企业客户共计400余家,客户研究成果发表在 Science, Nature Medice等顶级期刊50余篇。

枢密科技现有员工80余人,其中专业药物开发与药效评价,工艺开发人员,博士、硕士45人。总面积1700平方米,实验室面积约1200平方米,拥有分子生物学、细胞、病毒、纯化、检测分析实验、动物实验研究平台等,具备生物安全二级实验室资质。获国家高新技术企业武汉市光谷“3551人才”武汉市科技“小巨人”等荣誉资质。

 

我们的优势

经验丰富的技术团队

优质的合作平台

严格的质控体系

完善的实验研究平台

优质服务

 

招商业务

 

 

招商条件

成熟的终端销售网络,具有较强的市场运作能力

具有长期发展的合作意识及品牌推广能力

具有较强企业管理能力和资金实力

对相关市场及生物行业当地市场了解,有较强开拓当地区域市场的能力

高效专业的销售团队

 

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欢迎来电、来函接洽!

招商接洽电话:15327213341

公司地址:武汉市东湖高新技术开发区光谷七路128号

 

 

基因编辑服务之一:CRISPR/Cas9基因敲除

简介

CRISPR/CasClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas)系统是目前被广泛运用的基因编辑系统,其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列,对序列进行切割。其中最常用的是靶向DNACRISPR/Cas9系统,此系统是由IICRISPR/Cas系统改造而来,能够在植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物等多种细胞中,进行有效的靶向编辑,具有操作简易、效率高、以及作用靶位点多等优势。

CRISPR/Cas9系统中sgRNA(small guide RNA)识别并结合目标基因的靶向序列,引导Cas9对结合位点进行剪切,产生DNA双链断裂(double-strand break, DSB),机体自身通过非同源重组(non-homologous end joiningNHEJ)的方式修复DSB,参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基,修复后的基因由于产生突变而导致功能丧失,从而实现机体内的基因敲除(Gene Knockout)。

其中Cas9可根据不同菌属来源及大小进行分类,目前得到广泛应用的有SpCas9SaCas9SpCas9来源于化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9核酸酶,由1368个氨基酸组成,可识别的PAM序列为NGG ,由于构建载体载量过大,因此所选择的病毒载体有限,通常构建在慢病毒载体上;SaCas9是来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9核酸酶,由1053个氨基酸组成,可识别的PAM序列为NNGRRT,比SpCas925%,能够进行AAV病毒的包装,适用范围更广。

CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑(Wiles M V et al. Mammalian Genome, 2015


非同源重组修复DSBWiles M V et al. Mammalian Genome, 2015

应用

CRISPR/Cas9基因敲除细胞系建立

CRISPR/Cas9基因敲除建立动物疾病模型

技术优势

  1. 操作简易:仅需Cas9核酸酶和sgRNA即可对目标基因靶位点进行切割;
  2. 效率高:在基因组水平上编辑目标基因,高度模拟目标模型,可精确编辑基因组;
  3. 作用靶位点多:可实现多个靶基因位点及多个基因的同时敲除;
  4. 提供多种基因编辑病毒工具:AAVLV
  5. 提供 BSL-1 BSL-2 病毒注射及实验操作平台;
  6. 全面的实验技术支持。

服务内容

  1. sgRNA的设计;
  2. 细胞内sgRNA剪切活性筛选;
  3. 敲除载体的构建
  4. 依据所要编辑的细胞选择Cas9sgRNA不同导入方式

a、脂质体易转染细胞:使用质粒系统(Cas9sgRNA

b、 脂质体难转染细胞:使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染(Cas9sgRNA

5.筛选基因敲除单克隆细胞系

服务流程

客户提供

1、目的基因基因序列(序列/ID)以及物种来源

2、需介导基因敲除的细胞(可选)

3、病毒类型选择以及要求

4、血清型选择

 

服务信息及最终交付内容、产品

流程分布 周期(工作日) 交付内容 交付产品
sgRNA序列的设计 2~4 sgRNA设计分析报告

sgRNA的活性筛选 获得有活性的sgRNA及筛选报告
基因敲除质粒的构建 1 基因敲除质粒报告
病毒包装 3 病毒包装报告 高纯度病毒
单克隆细胞分选报告 8 单克隆细胞分选及检测结果报告 基因敲除单克隆细胞系

声明:枢密科技提供的所有基因编辑服务及该服务的后续研究仅适用在国家法律和伦理规范的范围内实施。禁止用于任何人体或临床实验的研究禁止用于对人类生殖体系进行基因修饰的研究禁止基因修饰的其他动物胚胎及生殖细胞植入人体客户如违反相关法律规定,本公司不承担任何法律责任。

 

案例展示

HaoyiWang等人研究发现,CRISPR / Cas介导的基因编辑允许高效地同时破坏小鼠胚胎干(ES)细胞中的五个基因(Tet123SryUty-8等位基因),通过NHEJ引入多个随机indel的靶向突变。将靶向Tet1Tet2Cas9 mRNAsgRNA共注射到受精卵中,在两种基因中产生具有双等位基因突变的小鼠,效率为80%。CRISPR / Cas系统允许一步产生携带多个基因突变的动物,这种方法将大大加速功能冗余基因和上位基因相互作用的体内研究。

小鼠胚胎干细胞的多基因敲除Wang H et al. Cell, 2013

    

小鼠和小鼠胚胎干细胞的多基因编辑(Wang H et al. Cell, 2013

参考文献

  1. Wiles M V , Qin W , Cheng A W , et al. CRISPR–Cas9-mediated genome editing and guide RNA design[J]. Mammalian Genome, 2015, 26(9-10).
  2. Wang H , Yang H , Shivalila C , et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering[J]. Cell, 2013, 153(4):910-918.

咨询电话:027-65023363

 

新型辅助感染试剂Enhancer A+B

产品简介:

本辅助感染试剂产品Enhancer A+B)分为A液(1000×)和B液(200×含有高价阳离子聚合物和胆固醇,能增强膜的通透性,显著提高逆转录病毒对细胞的感染效率。在慢病毒感染细胞,同时添加A液和B可以提高慢病毒感染效率4-10,本品增强效果优于polybrene对于慢病毒较难感染的细胞,使用辅助感染试剂可以使细胞获得较好的病毒感染效果以用于后续实验。

 

使用方法:

1.接种细胞

6孔板为例,每孔按1×106个待感染细胞接种铺板,每孔2mL完全培养基培养。

2.病毒感染

细胞接种24h,更换新鲜完全培养基。参考文献该细胞最适MOI(或通过病毒MOI梯度实验,确定最佳感染MOI)计算病毒使用量,加入对应体积慢病毒悬液进行感染,轻轻摇晃六孔板使其和均匀。

3.添加感染增强试剂

在接种病毒悬液之后随即加入辅助感染试剂A液和B2mL培养液为例,A液添加2μLB液添加10μL,轻轻摇晃六孔板使其和均匀。

(本产品可根据病毒感染难易情况选择使用,使用后放入-20℃保存)

4.换液

病毒感染4-6h后去掉病毒上清,更换新鲜完全培养基。

5.荧光观察

病毒感染48-72h后在荧光显微镜下观察病毒感染荧光效果。

 

感染效果图:

 

产品特点:

效果显著——提高慢病毒感染效率4-10倍

极地毒性——感染后保持良好的细胞状态

省时省心——极大程度简化繁琐的感染过程

 

运输:低温运输

储存:-20℃保存

 

枢密科技新型慢病毒辅助感染试剂

产品名称 产品规格
Enhancer A+B新型辅助感染试剂 A液:200ul,B液:1000ul
 

注意事项:经测试,辅助感染试剂对大多数细胞无毒害作用,但不排除有少数细胞对其敏感,使用时如出现在添加辅助感染试剂后细胞状态明显变差或者裂解死亡,则说明本辅助感试剂对该种细胞不适用,此时应撤掉辅助感染试剂,单独使用慢病毒悬液去感染细胞。

咨询电话:027-65023363

新一代无损伤钙离子探针GCaMP-X

许多重要的生物学过程如增殖转录代谢胞吐收缩凋亡等都有Ca2+的参与,因此,人们付出了巨大的努力来开发和改进分子工具来监测和量化细胞Ca2+的时空动态。利用基因编码钙离子指示剂(GECIs)进行荧光成像,在细胞群、单个细胞或亚细胞水平上检测Ca2+取得了快速进展钙离子成像技术是利用可以感应Ca2+浓度的钙离子指示剂检测的是细胞或组织中Ca2+的浓度变化,将钙浓度变化转化为荧光信号,从而使细胞电活动转化为可记录的光信号。钙离子指示剂分为两种,一种为化学指示剂,另一种为现在普遍使用的遗传编码指示剂,例如GCaMPGCaMP由绿色荧光蛋白(green fluorescent protein , GFP)、钙调蛋白(calmodulin, CaM)和肌球蛋白轻链激酶的一段肽段序列M13构成。当有Ca2+结合CaM时,CaM发生构象变化,其轻链区可以结合M13,致使GFP在特定波长的光照下其发色团的质子化作用增强,吸光度增加从而使GFP发出强烈的荧光。

 

GCaMP的结构及作用示意图(来源于维基百科)

然而,据报道GCaMP在多个方面造成了意想不到的副作用,主要是GCaMP引起的细胞损伤。GCaMP可能损害细胞和组织的整体健康,例如GCaMP2转基因小鼠心脏的心肌肥大【1-2,以及神经元的细胞毒性或死亡3-4GCaMP5转基因小鼠的海马神经元中观察到放电频率的增加5这些副作用似乎与GCaMP在细胞核内的异常堆积密切相关,通常伴随着神经元内Ca2+动力学的衰减【3-4, 6

窗体顶端

窗体底端

2018417日,北京航空航天大学生物医学工程高精尖创新中心刘晓冬研究组在Nature Communications在线发表了题为“Improved Calcium Sensor GCaMP-X Overcomes the Calcium Channel Perturbations Induced by the Calmodulin in GCaMP”的论文。该研究首次揭示了含有CaMGCaMP干扰了L型钙通道(CaV1)的门控和信号传导,破坏Ca2+动力学和基因表达,并通过GCaMP氮端引入能够特异结合apoCaM的保护元件,设计出了新一代无损伤钙离子探针——GCaMP-X,有效地保护了依赖于CaV1的兴奋-转录耦合免受干扰,同时仍表现出部分GCaMP的优良Ca2+感应特性

 

GCaMP干扰神经元L型电压门控钙通道(CaV1.3

CaV1.3是神经元表达的CaV1通道的一个主要亚型,与细胞核内的转录信号紧密耦合。作者发现,GCaMP能与CaV1.3结合,导致CaV1.3的门控显著增强,钙离子内流增加(图1)。

1. GCaMP干扰神经元L型电压门控钙通道(CaV1.3

GCaMP导致神经元退化和凋亡

作者还发现,GCaMP也会干扰CaM正常情况下响应CaV1.3钙信号的核迁移过程,长时程表达时引发GCaMP异常核聚集。入核GCaMP扰乱了转录因子CREB信号通路的正常运转,导致神经元退化和凋亡(图2)。

2. GCaMP导致神经元退化和凋亡

GCaMP-X避免了对钙通道门控的干扰

作者在GCaMP氮端引入特异性apoCaM保护元件,合成了新一代钙离子探针——GCaMP-XGCaMP-X有效地解决了有害核积累、急性和慢性Ca2+失调、转录信号异常和细胞形态异常等问题,同时仍表现出GCaMP的优良Ca2+特性(图3

  

3. GCaMP-X避免了对钙通道门控的干扰

GCaMP-X在长时程的钙离子监测中更有优势

作者用电穿孔法在机械敏感的外毛发细胞中转染GCaMP6mGCaMP6m-XC,在短时间的细胞培养中(1天,DIV1),GCaMP6m-XCGCaMP6m在监测Ca2+信号时无明显差异。而在较长时间的细胞培养( 3天,DIV3)中,GCaMP6m的副作用(例如干扰外毛发细胞中的CaV1.3)将出现。将100300500 ms的射流脉冲施加到细胞上,与表达GCaMP6m-XC的细胞相比,GCaMP6m表现为较弱的Ca2+信号反应,引起Ca2+信号的衰减,而GCaMP6m-XC避免了这个问题(图4)。

4. GCaMP6m-XcGCaMP6m的钙离子监测比较

作者进一步在GCaMP碳端加入定位序列,如:检测近膜钙信号的GCaMP-XM探针,以及特异性定位于细胞核的GCaMP-XN探针,以实现监测胞质、膜下和核钙信号,满足不同实验研究的需要。新一代无损伤探针GCaMP-X有效地解决了传统GCaMP探针的弊端,能够安全无损、长时程、精准、特异、多细胞器的定量钙信号监测。这项研究未来基于CaM的分子工具的设计有指导意义

刘晓冬课题组致力于如下几个方面的研究:1)电压门控钙通道CaV门控-信号耦联(如兴奋-转录耦联)机制及调控;2)基于新型钙探针GCaMP-X的长时程、亚细胞钙信号定量监控;3)感觉刺激响应型钙通道TRP的结构-功能研究;4)重要钙通道的病生理关联。此论文是该实验室继前期工作(《自然》Nature 2010;《细胞•报告》 Cell Reports 2015;《e生命》eLife 2017;及《自然•通讯》 Nature Communications 2018等)的最新研究进展。该项研究得到了国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委、清华大学麦戈文脑科学研究所等方面的支持。

原文链接:

https://www.nature.com/articles/s41467-018-03719-6

 

参考文献:

  1. Tallini, Y. N. et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: Cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proc. Natl Acad. Sci. 103, 47534758 (2006)
  2. Colomer, J. M., Terasawa, M. & Means, A. R. Targeted expression of calmodulin increases ventricular cardiomyocyte proliferation and deoxyribonucleic acid synthesis during mouse development. Endocrinology 145, 13561366 (2004).
  3. Tian, L. et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods 6, 875881 (2009).
  4. Resendez, S. L. et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with headmounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat. Protoc. 11, 566597 (2016).
  5. Gee, J. M. et al. Imaging activity in neurons and glia with a Polr2a-based and cre-dependent GCaMP5G-IRES-tdTomato reporter mouse. Neuron 83, 10581072 (2014).
  6. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L. & Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13, 14331440 (2010). 

枢密科技GCaMP-X产品列表:

产品编号 产品名称 启动子 Cre/Flp依赖
PT-1464  rAAV-hSyn-GCaMP6m-XC-WPRE-hGHpolyA hSyn

 北京航天航空大学刘晓冬课题组独家授权!欢迎咨询!

 

GCaMP-X优势:

  1. 精准、特异且安全无损;
  2. 特别适合超长时程≥4周)钙信号的监

 

测试结果:

测试病毒AAV-hSyn-GCaMP6m-XC滴度:1.0x10^12,血清型:2/9

对照病毒AAV-hSyn-GCaMP6m滴度:1.2x10^12,血清型:2/9

注射区域:在同一只小鼠左脑皮层区域注射GCaMP6m,右脑皮层区域注射GCaMP6m-XC

注射量:各100 nl

图一:同一只小鼠左右脑皮层分别注射GCaMP6mGCaMP6m-XC病毒,表达3周时长,左脑皮层神经元出现GCaMP6m显著进核现象,而右脑皮层神经元GCaMP6m-XC无进核现象。

图一、 病毒注射3周后表达状态对比刘晓冬课题组提供

图二:步骤同上,表达13周时长,左脑皮层神经元GCaMP6m显著进核,而右脑皮层神经元GCaMP6m-XC依然无进核现象。

图二、 病毒注射13周后表达状态对比刘晓冬课题组提供

注意:低滴度GCaMP6m-XC表达量相对较低,可能会不利于在体双光子实验,推荐使用者使用10^13高滴度病毒,可有效提高表达量,有利于在体双光子实验。

咨询电话:027-65023363

 

AAV现货我更低价

活动时间:

20190622——20190902

活动内容:

一、每满4900元  送  5000

所有对照产品不参此活动;

赠送金额仅限AAVLV现货产品;

须在20191015日前一次使用;

预付款折后满4900可享受此活动.

 

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* 本活动最终解释权归枢密科技所有

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jGCaMP7——高性能基因编码钙离子探针

利用基因编码钙指示剂(genetically encoded calcium indicators,GECIs)测量神经元活动已成为神经科学中广泛使用的方法,GECIs进行钙成像通常用于测量完整神经系统的神经活动,如检测大量神经元胞体的活动,或追踪神经元亚细胞(如轴突、树突和单个突触)的动态。尽管取得了重大进展,但钙成像仍然受到现有GECIs的生物物理特性的限制,包括亲和力、信噪比、灵敏度、半衰期以及动态范围,因此,GECIs在这些方面还有待改进。

        2019617日,来自霍华德休斯医学研究所的Karel SvobodaLoren LoogerVivek Jayaraman等课题组合作的“GENIE项目组在顶级期刊Nature Methods上发表了题为“High-performance calcium sensors for imagingactivity in neuronal populations and microcompartments”的研究成果。该论文系统地介绍了新一代基因编码的钙离子探针jGCaMP7系列,专门用于检测特定环境下的神经元活动。jGCaMP7包括:jGCaMP7s(灵敏)jGCaMP7f(快速动力学)jGCaMP7b(较亮的基线荧光)jGCaMP7c(高对比度)jGCaMP7在体内和体外都进行了测试,其性能明显优于GCaMP6

研究人员利用在存在或不存在Ca2+GCaMP的晶体结构,确定了可能影响指示剂关键性质的位置,包括静息荧光和峰值荧光,以及结合和不结合Ca2+的亲和力和动力学。GCaMP包括一个与钙调蛋白(CaM)融合的环状排列GFP(cpGFP)和一个来自肌球蛋白轻链激酶(Rs20,也称为M13)的钙调蛋白结合肽。钙调蛋白依赖的构象变化及其与M13GFP的相互作用调节GFP发色团环境并影响荧光。对GFP-CaM接口和CaM-M13相互作用接口进行了定点突变(1a)。通过电极刺激培养神经元筛选662个变异的jGCaMP7(1c),继续在体外特性研究中得到了性能优良的jGCaMP7sjGCaMP7fjGCaMP7bjGCaMP7c其中,jGCaMP7s灵敏性可达GCaMP6s5倍以上,且速也快于GCaMP6sjGCaMP7b灵敏度达到GCaMP6s3倍,荧光亮度增强50%jGCaMP7c灵敏度是GCaMP6s2.7倍,且对比度增强;jGCaMP7f反应速GCaMP6f 5倍及GCaMP6s3(2)

1. 分离神经元中jGCaMP7的突变与筛选

2. jGCaMP7的筛选及体外特性研究

通过优化钙离子探针的Ca2+亲和力同时进一步提高探针的灵敏度、信噪比、半衰期和动态范围,研发出了jGCaMP7系列。追神经元亚细胞的动态对神经环路研究具有重要意义,而树突、轴突等亚细胞结构小,jGCaMP6灵敏度低,成像保真度不高,而jGCaMP7sjGCaMP7fjGCaMP7b很大程度上提高了在不同钙离子浓度下的灵敏度,jGCaMP7f同时具有较快的反应速率,这对于神经元亚细胞的动态检测非常重要。

研究人员随后在在体水平验证了jGCaMP7。在检测jGCaMP7在成年果蝇椭球体神经元的表现中,检测对于闭环视觉刺激下的运动果蝇的树突神经活动,通过双光子成像发现jGCaMP7f相比GCaMP6f表现出更高的检测灵敏度(3)。通过对小鼠初级视觉皮层双光子成像中,发现jGCaMP7b相比于GCaMP6s能够在更多的树突棘中检测到对视觉刺激的反应(4)

3. jGCaMP7在成年果蝇椭球体神经元中的表现

4. 树突棘中钙信号的检测

目前jGCaMP7已经被广泛用于线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等多个模式生物的研究。未来GCaMP的改进可能需要最大限度地增加其荧光强度,这将需要对GCaMP骨架进行重大改变,例如用更明亮的荧光蛋白取代cpGFP,用cpGFP发色团重新设计CaM-M13接口,或者使用完全不同的荧光基团。

枢密科技jGCaMP7系列钙离子探针列表:

产品编号 产品名称 启动子 Cre/Flp依赖
PT-1421 rAAV-CAG-FLEX-jGCaMP7s CAG Cre依赖
PT-1422 rAAV-CAG-FLEX-jGCaMP7f CAG Cre依赖
PT-1423 rAAV-CAG-FLEX-jGCaMP7b CAG Cre依赖
PT-1424 rAAV-CAG-FLEX-jGCaMP7c CAG Cre依赖

欢迎咨询!