钙离子/电压探针成像

钙离子成像技术

1.背景介绍

钙离子成像技术(Calcium imaging system)属于光遗传学技术中的一类,实际检测的是细胞或组织中Ca2+的浓度变化,将钙浓度变化转化为荧光信号,从而使细胞电活动转化为可记录的光信号。检测的手段是利用可以感应Ca2+的浓度的钙离子指示剂完成的。钙离子指示剂分为两种,一种为化学指示剂,另一种为现在普遍使用的遗传编码指示剂,例如Gcamp。Gcamp由绿色荧光蛋白(green fluorescent protein ,GFP),钙调蛋白(calmodulin,CaM)和肌球蛋白轻链激酶的一段肽段序列M13构成。当有Ca2+结合CaM时,CaM发生构象变化,其铰链区可以结合M13,致使GFP在特定波长的光照下其发色团的质子化作用增强,吸光度增加从而使GFP发出强烈的荧光。如下图所示。

图片来自维基百科

下图是钙浓度变化指示蛋白示意图。(a)钙离子参与细胞活动的方方面面。钙离子是细胞信号传导中的重要信使,因为一旦它们进入细胞质,钙离子会结合并激活很多酶和蛋白质。由下图所示的细胞为例,钙离子通过AMPA(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体)受体、NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体等离子通道进入细胞,可引发一系列突触后膜的活动,由此可能引发突触结构性的变化,比如更多的AMPA受体插入膜上。在细胞胞体内流的钙离子,或者细胞内钙库释放的钙离子结合钙调蛋白,可影响基因表达。在神经细胞轴突末梢流入的钙离子,是神经递质释放的前提条件;(b)基因工程重组钙敏感荧光蛋白(genetically encoded calcium indicator由Ro bert E. Campbel设计;(c) 细胞兴奋前后荧光量的变化;(d)荧光强度随着细胞内钙的浓度变化而波动。

2.技术应用

钙离子成像技术广泛应用于神经生物学,细胞生物学,生理学,发育生物学和药物学领域中。其中,神经生物学中主要研究神经细胞离子浓度改变引发的信号发射,生理学中主要研究肌肉运动-心肌细胞中的钙信号,细胞生物学中主要研究信号传导和离子通道,发育生物学中主要研究卵受精机制,药物学中主要用于筛选药物、药效学考察等方面。

枢密科技在Gcamp技术运用主要在于两个方面,通过记录被GFP标记到的神经细胞发光的有无和强弱判断神经细胞活动,通过记录被GFP标记到的神经细胞的电信号反映神经细胞活动。技术包括钙离子光纤记录和双光子活体神经元观测。

钙离子光纤记录:钙离子光纤记录除了使用带有Gcamp的病毒外,还要利用到光纤,以此记录到被GFP标记到的神经细胞的电信号。

双光子活体神经元观测:利用双光子成像技术,在给与活体刺激时,记录被GFP标记到的神经细胞的光变化。

电压成像技术

1.背景介绍

神经细胞的活动有两个重要的指标:第一个是细胞膜电位的变化,第二个是细胞内钙离子浓度变化,下面分别描述测量这两个指标的方法。神经细胞的膜电位变化是神经细胞活动最基本的信号,当膜电位变化时,细胞膜上镶嵌的许多蛋白质分子都会改变形状,因此改变膜电位是一个细胞指挥自己身上亿万个蛋白分子统一行动的信号,这类随膜电位改变形状的蛋白分子也叫电压敏感蛋白。如果用基因工程的办法,把电压敏感蛋白和荧光蛋白连接起来,当膜电位改变时,电压敏感蛋白的改变就会影响荧光蛋白的结构,从而改变了后者的发光特性。这样就可以利用荧光来看神经细胞膜的膜电位变化了。

Arclight是电压敏感蛋白中的一种,属于基因编码荧光指示蛋白(genetically encoded fluorescent voltage indicators,GEVIs),它能随着神经细胞的电压变化而发出荧光,因此研究人员就能实时观测到细胞中的电活性。基因编码的电压指示器能告诉我们细胞膜电位的波动,因此相比于钙指标,更能直接反映神经元的活性。这种感应器与传统的电生理技术不同,能在同一时间分析多种定义神经元的活性。
耶鲁大学医学院的研究组改造了果蝇,令其控制果蝇睡眠周期或嗅觉的大脑细胞表达ArcLight。这样研究人员利用显微镜观察到了大脑细胞电活性,并且通过电极记录下了电压,研究结果表明ArcLight能精确的监控活体大脑中的电活性。

2.技术应用
1.电压成像技术也属于光遗传学中的一种,主要用于记录细胞电位的变化,从而反映细胞的活动,在神经科学领域正在得到重用。
2.可以运用于描述神经环路,正常和疾病状态下大脑的电环路。
3.结合双光子成像技术,实时反映神经细胞的电活动

病毒工具

 

参考文献

[1] Esposti F, Johnston J, Rosa JM, Leung KM, Lagnado L. Olfactory Stimulation Selectively Modulates the OFF Pathway in the Retina of Zebrafish. Neuron.2013, 79:97-110.
[2]Tsai-Wen Chen, Trevor J. Wardill, Yi Sun, Stefan R. Pulver, Sabine L. Renninger, Amy Baohan, Eric R. Schreiter, Rex A. Kerr, Michael B. Orger, Vivek Jayaraman, Loren L. Looger, Karel Svoboda & Douglas S. Kim. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 2013 July 18; 499(7458): 295–300.
[3] Hod Dana, Tsai-Wen Chen, Amy Hu, Brenda C. Shields, Caiying Guo, Loren L. Looger, Douglas S. Kim, and Karel Svoboda. Thy1-GCaMP6 Transgenic Mice for Neuronal Population Imaging In vivo. PLoS One. 2014; 9(9): e108697.
[4] Fosque, Benjamin F., et al. Labeling of active neural circuits in vivo with designed calcium integrators. Science. 2015 Feb 13;347(6223):755-60.
[5]Berlin S, Carroll EC, Newman ZL, et al. Photoactivatable genetically encoded calcium indicators for targeted neuronal imaging. Nat Methods, 2015, 12(9): 852-8.

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