光纤记录

光纤记录概述

光纤记录的目的是实时检测细胞的活性变化。基于钙离子浓度变化的荧光成像技术被广泛用来记录神经元活性。钙离子浓度敏感蛋白GCaMP通过荧光信号强度变化可以很好地表征神经元的活性,其中GCaMP6具有很高的时间灵敏度和荧光信号信噪比(Chen, 2013)。将GCaMP表达到神经元中,然后通过光纤激发GCaMP的荧光并实时监测记录荧光信号强度的方法即光纤记录(Gunaydin, 2014; Guo, 2015)。

光纤记录方法与传统的在体电生理记录方法有着不同的特点。首先,将GCaMP表达在特定类型的神经元中,光纤记录可以实现细胞类型特异性的活性检测,而用电生理记录的方法记录特定类型的神经元的活性比较困难。其次,电生理记录容易受到环境中的电信号以及动物的行为动作影响,而光纤记录相对来说有着较强的抗干扰性能。然后,光纤记录相对稳定,可以很容易实现长时程的活性检测,例如动物的整个学习过程,而利用电生理记录实现起来则相对困难。最后,光纤记录用神经元群体的荧光强度变化来表征神经元整体的活性变化,不能反映单个神经元的活性,而电生理记录则能够检测到单个神经元的活性,具有更高的空间分辨率。

光纤记录因其稳定、方便、易上手而应用广泛。首先,光纤记录可以应用在各类奖赏和惩罚类行为,例如电生理记录动物在摄取食物(图1)或者遭受足底电击时的神经元活性通常会产生很大的电信号噪音,而光纤记录则不会。其次,光纤记录可以应用在各类社会性行为中(图 2),例如社会交往,交配以及打架行为等。光纤记录还可以应用在学习相关的行为中,光纤记录能够长时程稳定检测神经元活性随着动物学习过程的变化情况。其它的各类行为如焦虑相关的行为等均可使用光纤记录观测神经元活性与行为的相关性。

光纤记录常用病毒工具

注:GcaMP6是一种超灵敏的荧光蛋白,可以特异高效地反映细胞内游离Ca2+浓度的变化,在活体下,对单个动作电位诱发的钙信号,GCaMP6比GCaMP3强10倍,动力学快2倍。因此GcaMP6荧光蛋白可以作为一种超敏Ca2+探针,用于研究生理和病理情况下外界因素对活细胞内Ca2+的影响。CaMPARI这种蛋白质在基准状态下会发出绿色荧光,而如果对其同时使用高浓度的钙离子与紫外光照射处理,它就会不可逆地转变成另一种能发出红色荧光的构象。他们将这种新型蛋白命名为“钙调光激活比率积分传感器”(calcium-modulated photoactivatable ratiometric integrator),简称CaMPARI。

实验方法(仅供参考)

1.光纤陶瓷插芯植入
第一步,制作光纤陶瓷插芯。光纤切割刀(Fiber Cleaver, ART-07A)将直径为230 μm的裸纤切割成末端平整的长度为18 mm-20 mm的小段,将切好的光纤小段插入内径为230 μm的SC型的陶瓷插芯中(数值孔径 0.37,上海斐波光电),从有凹槽的陶瓷插芯一端容易插入,使其末端刚好伸出陶瓷插芯平面端(< 1 mm)。一只手用弯头镊子夹持陶瓷插芯,另一只手用牙签在凹槽端涂抹混合好的环氧环氧树脂胶(Devcon,14265,5 min epoxy gel),涂抹后的胶呈锥体,高度在1 mm – 2 mm间,底端直径和陶瓷插芯直径相近。在体视镜(Olympus,SZ61)下,用弯头镊子夹持陶瓷插芯,通过将陶瓷插芯末端调整光纤末端使其与陶瓷插芯平端平齐,并将其小心将其横向放置在干净的A4纸上,等待胶变硬从而将光纤固定在陶瓷插芯内。为了保证传光效率,尽量保证光纤末端和陶瓷插芯末端平齐,只有传光效率达到70%以上的光纤陶瓷插芯才被用来植入小鼠脑内。

第二步,光纤陶瓷插芯植入。需要保证小鼠脑表面不能有血液渗出,如果有血液渗出需要用生理盐水冲洗,并用真空泵抽吸干净颅骨表面水分。将光纤末端缓慢插入脑组织并停在目标区域处,用吸水纸小心的吸走光纤周围的液体,待头骨完全干燥时,用牙科水泥(自凝型II型义齿基托树脂粉剂和液剂混合)固定。大约20min 后,牙科水泥完全硬化,此时,小心的移走光纤陶瓷插芯夹持杆。通常情况下,为了光纤陶瓷插芯能够牢固地固定在头骨上,可以在小鼠头骨植入一颗1 mm粗细2 mm高度的小螺丝。为防止感染,将林可霉素利多卡因软膏涂抹在伤口处,然后将小鼠放在加热器旁待其苏醒。手术后的小鼠在一周后大部分可以恢复健康状态。

2.光纤记录系统
光纤记录系统原理上可以分为荧光激发系统和荧光收集系统(如图1a)。荧光激发系统的光源是488 nm波长的激光器(OBIS 488LS;Coherent),从光源发出的光经过1% 的衰减片(大恒光电)衰减后被二向色镜(dichroic mirror,MD498,Thorlabs)反射光从垂直角度射出,该光束经过一个10倍放大的物镜(数值孔径0.3,Olympus)后被聚焦到光纤跳线的纤芯端面上。光纤跳线通过陶瓷插芯连接器与动物头部固定的光纤陶瓷插芯连接,激发光经过光纤跳线和动物头部陶瓷插芯后到达特定脑区,从而激发绿色荧光信号。被激发的荧光信号的强度可以被植入动物脑内的光纤末端收集,反向沿着光纤跳线和物镜传播,到达二向色镜(DM)后直接穿过,经过一个在GFP波长范围内的带通滤波片(MF525-39,Thorlabs)后,荧光强度信号被光电倍增管(PMT,R3896,Hamamatsu)检测并转换成电流信号。电流信号经过光电倍增管配套的放大器(C7319, Hamamatsu)后变成模拟电压信号,模拟电压信号进一步经过一个低通滤波器(40 Hz)后,输入到数据采集系统以200-500 Hz的采样频率记录保存。

光纤记录时光纤末端的光强应控制在10-30 μW以降低荧光漂白。整个环境的亮度会影响光纤记录系统,所以光纤记录的实验室在黑暗环境中或者用弱亮度的红灯作为光源。另外,一个光信号转接器(Doric Lenses)连接在光纤跳线(230 μm,数值孔径0.37,2 m长)的一端可以防止记录的时候光纤扭曲打结。

3.数据分析
光纤记录的结果读入Matlab。然后我们将荧光信号根据行为划分成不同的小段,并使其按照特定的行为事件为时间零点对应整齐。我们用当前荧光强度F和基线荧光强度F0的差值再除以基线荧光强度F0的值即ΔF/F = (F−F0)/F0的值来表征事件周围的荧光强度变化。基线荧光强度F0的选取需根据实际情况设定。

分析的结果可以用两种图表征:一种是热度图(heatmap),另外一种是事件相关的线图(peri-event plot)。在热度图中,所有次数的实验结果,按照事件零点对齐,按顺序排列呈现,实验结果的幅度值大小是用不同的颜色来表征的。我们通常用暖色调表征大的荧光强度变化,冷色调表征小的或者反向的荧光强度变化。事件相关的线图描述的是所有次数实验结果的一个平均值,与热度图不同,其并不能反映出每次试验的细节信息。

应用举例

图 1水和食物的摄取激活中缝背核5-HT神经元。(a)用光纤记录系统记录表达钙离子浓度敏感蛋白GCaMP6的SERT-Cre小鼠中缝背核5-HT神经元在小鼠主动摄取糖水和食物时钙信号的变化的示意图。用PMT,光电倍增管;DM,二向色镜。(b)一只小鼠在一个完整的试验阶段中摄取糖水时5-HT神经元钙信号的变化。热度图(上面)展示了每个回合按照小鼠舔舐动作起始对齐之后的结果。每行代表一个回合的数据,这里总共显示了从下到上的14个回合的数据。F/F 表示荧光强度的相对变化幅度,暖色调表征较大的F/F 。事件相关的线图(下面)表示所有回合钙信号的平均,垂直虚线表示小鼠舔舐动作的起始,黑色的实线表示5-HT神经元钙信号的平均值,灰色阴影表示样本平均数的标准误。附着在平均值线条上的一段红色线条表示:通过多变量置换检验,这段时间内的钙信号水平与基线水平有显著性差异,阈值是0.05。(c)小鼠中缝背核5-HT神经元在小鼠摄取食物时钙信号的变化。同(b)中的描述,只是钙信号的数据是按照小鼠摄取食物开始的时间对齐的。

图 2奖赏性的社会行为激活中缝背核5-HT神经元。(a和b)雄性小鼠交配雌性小鼠时中缝背核5-HT神经元的钙信号变化。热度图和事件相关的线图都是按照雄性小鼠交配雌鼠事件的开始对齐(垂直虚线)。黑色粗线表示平均值,灰色阴影区表示标准误。覆盖在平均值上的红色表示这段时间内钙信号强度在统计上的显著升高(置换检验,阈值0.05)。(a)光纤记录的雄性小鼠交配雌性小鼠的视频截图。(b)一只表达GCaMP6的SERT-Cre小鼠,在不同回合的交配雌鼠时,中缝背核5-HT神经元的钙信号变化。暖色调表征较大的F/F 。(c和d)雄性SERT-Cre小鼠探索进入其领地的陌生雄性小鼠时,中缝背核5-HT神经元钙信号活性变化。呈现方式与(a和b)相同。钙信号以每个回合雄性小鼠探索入侵者开始的时间对齐。

参考文献

[1]Chen, T.W., Wardill, T.J., Sun, Y., Pulver, S.R., Renninger, S.L., Baohan, A., Schreiter, E.R., Kerr, R.A., Orger, M.B., Jayaraman, V., et al. (2013). Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature 499, 295-300.
[2]Gunaydin, L.A., Grosenick, L., Finkelstein, J.C., Kauvar, I.V., Fenno, L.E., Adhikari, A., Lammel, S., Mirzabekov, J.J., Airan, R.D., Zalocusky, K.A., et al. (2014). Natural neural projection dynamics underlying social behavior. Cell 157, 1535-1551.
[3]Guo, Q., Zhou, J., Feng, Q., Lin, R., Gong, H., Luo, Q., Zeng, S., Luo, M., and Fu, L. (2015). Multi-channel fiber photometry for population neuronal activity recording. Biomedical optics express 6, 3919-3931.
[4]Li, Y., Zhong, W., Wang, D., Feng, Q., Liu, Z., Zhou, J., Jia, C., Hu, F., Zeng, J., Guo, Q., Fu, L., Luo, M. (2016). Serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus encode reward signals. Nat Commun 7, 10503.

感谢李毅提供相关材料

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