光遗传技术

光遗传学技术研究的优势

光遗传学技术(optogenetics)—利用光来激活或者抑制神经元的活性,其时空分辨率几乎和神经细胞的活动过程一样都是亚毫秒和毫秒级。通过选择只对特定神经蛋白如神经递质受体反应的光敏感化合物,如笼锁解笼锁化合物,或者用基因方法通过携带不同启动子(promoter)将光敏感物质导入感兴趣的特定细胞亚群(如谷氨酸能神经元、γ-氨基丁酸能神经元等),都能实现大脑内组织结构上的特异性。如果连接上报告基因(如荧光蛋白),通过基因导入到大脑执行特定功能区域中的某类神经细胞,我们甚至能够在大脑执行特定任务的同时,可视化地调控和记录细胞亚群的反应,然后让细胞将这种反应进行重现,从而明确这一类细胞对行为的功能性作用。

此前研究神经回路的主要方法是通过电极对某一靶点进行电刺激,同时记录电生理信号。虽然这种方法有较高的时间分辨率,但是,这种方法空间分辨率和细胞特异性较差,不能选择性地对某一类型的细胞进行研究(见图1-1)。并且电刺激时对电生理记录的干扰较大,给实验的设计和进行造成了困难。

光遗传学技术通过基因工程方法将光敏感蛋白表达在单一来源的特定细胞群(兴奋或抑制神经元、神经元或神经胶质细胞等),因此不表达光敏感蛋白的细胞对光刺激没有反应(图1)。除了细胞特异性,光敏感蛋白还可以顺着感染的神经元胞体向突触生长,甚至跨越一级突触向下一级神经元的胞体[8],因此光遗传学技术又具有细胞空间投射的特异性,这对于神经环路中各脑区特定细胞群的调控具有无与伦比的精准性。通常一条神经回路是由若干个执行同一任务的核团组成,首先解剖学上,通过荧光蛋白就可以观察各脑区直接的投射关系,其次可以通过刺激上游核团,记录下游核团的电生理或影像学反应来判定其有无功能联系,亦可刺激上游核团投射到下游核团的轴突来监测这些功能变化,亦或刺激更下游核团。这样就可以解析出完整的投射关系,描绘出整条可能的神经回路。

图1 电刺激和光刺激的区别

光遗传学常用的病毒工具

光遗传学研究的步骤

用光遗传学技术进行科学研究的常规步骤,一般简单来说,首先选择合适的光敏感蛋白,利用病毒注射或转基因的方法将其表达在拟研究脑区特定种类的神经细胞上,然后将光导入该区域,选择不同的参数进行光刺激,通过电生理记录或行为学测试等方法,将光刺激对神经元、神经回路、动物行为的改变呈现出来。可以分为如下几个方面进行阐述:

1、细胞特异性标记方法
光遗传学技术通过一定波长的光对细胞进行选择性地兴奋或者抑制,达到控制特定类型细胞活动的目的。光遗传学技术对细胞的选择性目前主要通过三种方法实现:

1) 通过病毒载体直接选择性表达光感基因。相比转基因动物,病毒载体具有很多优势,包括:制备周期短,从载体克隆到病毒表达只需要数周时间就可以完成;可用于难以转基因的动物,如灵长类等;病毒表达只局限于注射位点,如某个特定的脑区,因此具有空间选择性;某些病毒具有天然嗜性,只感染一些特定的细胞类型等。目前广泛用于光遗传学研究的病毒载体是慢病毒和腺相关病毒载体。
2) 通过转基因动物直接选择性表达光感基因。转基因动物已经成为一项成熟的技术,转基因动物比局部通过病毒转染而导入光敏感通道的方法具有遗传稳定、效率高等优点。
3) 依赖重组酶(Cre)的腺相关病毒选择性表达光感基因。相比直接转光感基因动物,依赖重组酶的光感基因表达系统具有更好的空间选择性,另外,因为Cre重组酶的特异性表达决定了细胞选择性,因此可以方便地更换各种光感基因腺相关病毒。相比直接表达的病毒载体系统,依赖重组酶的光感基因表达系统的细胞选择性更广泛,结合目前已经培育的很多Cre转基因小鼠品系,能够满足大部分细胞选择性的实验要求。

2、光刺激参数的选择
通常来说光刺激的参数主要包括波长、光强度、频率和占空比。波长取决于光敏感蛋白的种类,如ChR2可以选择473nm激光器,NpHR选择593nm激光器。对于兴奋性光敏感通道蛋白来说光强度的选择很大程度上依赖其自身的特性,不同的光敏感蛋白有不同的光刺激阈值,取决于细胞受光刺激后产生内向电流的大小,电流越大,越容易爆发动作电位,需要的光强相对越低。光强太大容易产生额外的动作电位,延长刺激时间即脉宽也增加了内流入细胞的阳离子量,同样会产生非一对一的光电流,这与光遗传学技术精细调控神经元的优点是相悖的,因此要采取合适的光强和刺激脉宽。最重要的是频率的选择,因为大脑的神经元都有各自合适的放电频率,一般来说锥体神经元放电频率在10Hz左右,而抑制性中间神经元放电频率高达40Hz以上。同时刺激频率还与光敏感蛋白本身的动力学特征有关,野生型的ChR2在40Hz以上光刺激时大部分动作电位都丢失了,甚至呈现一种“抑制”的现象,而作为变体的ChETA,如果表达在PV神经元上,即使光刺激频率高达200Hz,依然能产生一对一的响应。而对于抑制性的NpHR、Arch或Mac来说,连续的光照才能很好的消除细胞的自发电活动。因此,实验前首先考虑的是要刺激的神经元类型,选择合适的光敏感蛋白,再确定光刺激的各种参数。

3、电生理记录及行为学
光遗传学技术正在改变传统的行为学测试方法。传统的行为药理学实验中根据不同药物代谢时间的长短,需要一个较长的洗脱(wash-out)时间,而对于光遗传学技术来说,无论是利用兴奋性的ChR2还是抑制性的NpHR,在光停止的刹那,几乎就可以停止光刺激带来的效应。另外,在实验中光刺激的参数可以灵活改变,以便寻找合适的光刺激参数,而药物刺激则不能。
光遗传学技术的高时间分辨特性要求其读出(read-out)系统具有较高的时间分辨率,这样在数据分析时才能建立良好的时间依赖(time-dependent)关系。利用电生理技术记录神经元的电活动可以直接反映细胞的活动,是评价光刺激对神经元影响效果的最佳参数。此外,光刺激的高空间特异性,也需要匹配具有较高空间分辨率的读出系统,而记录电极可以精确定位到所记录的核团。光遗传学电生理实验中,可以在同一脑区植入光电极,进行原位的光刺激和电生理信号采集,或者在神经环路的上游核团植入光纤或者光电极进行光刺激,在下游核团埋入电极同步采集信息,将光刺激和电信号建立相关性,并同行为学数据整合起来,极大丰富了实验内容和结果,使研究成果更加令人信服。光遗传学应用实例如图2。

图2:(a) Schematic of analysing the function of ILSCm–LP pathway. A optic fibre was implanted in the ipsilateral LP of ChR2:ILSCm mice. In addition, a recording electrode was placed in the LA. (b) Confocal image of ChR2-positive terminals in the LP(LR) that from the ILSCm and the tip of optic fibre (the top dotted rectangle). red=mCherry; blue=DAPI. (c) Time courses of the averaged FS reveals that the US (blue rectangle) of ChR2:ILSCm–LP(LR) terminals elicits UF and a prolonged lower FS (blue) compared with the control (black) (n=8 subjects for per group; P<0.05 by t-test). (d) Spatial FS map of the pre- or post-US period (3 min) from a sample ChR2:ILSCm–LP(LR) mouse. The ‘light on’ symbol indicates the onset of the US. (e) The UF elicited by the US of ILSCm–LP(LR) terminals adapts significantly after repeated trials (blue dots, n=8 subjects, main effect P<0.001 by repeated one-way ANOVA). (f) Time courses of the normalized distance to the centre of the arena reveal that animals prefer the periphery of the arena after they are relieved of the UF elicited by the US of ChR2:ILSCm–LP(LR) terminals. (g,h) Time spent in the centre of the arena (g) and the animal speed (h) show a significant reduction in the post-UF period for the US of ChR2:ILSCm–LP(LR) terminals (n=8 subjects for per group; **P<0.01 by two-way ANOVA with Holm–Sidak post-hoc test). (i) Box plots of the duration of UF elicited by the US. The glutamate receptor antagonists NBQX plus AP5 (D(-)-2-amino-5-phosphonovaleric acid) infusion in LP(LR) blocks the UF response (n=7–8 subjects per group; ***P<0.001 by Kruskal–Wallis one-way ANOVA with Dunn’s post-hoc test). (j,k) A sample LA neuron is activated by the pulsed laser in the upstream ILSCm–LP(LR) terminals (peak response latency ≈5 ms, (k). Values are represented as mean±s.d.; (b) 250 μm

参考文献:

[1] Wei P1, Liu N1, Zhang Z2, Liu X,et al. Processing of visually evoked innate fear by a non-canonical thalamic pathway. Nat Commun. 2015 Apr 9;6:6756.
[2] Adolphs, R., Tranel, D., Damasio, H. & Damasio, A. Impaired recognition of emotion in facial expressions following bilateral damage to the human amygdala. Nature 372, 669–672 (1994).
[3] Shi, C. & Davis, M. Visual pathways involved in fear conditioning measured with fear-potentiated startle: behavioural and anatomic studies. J. Neurosci. 21, 9844–9855 (2001).
[4] Yang H, Yang J, Xi W,et al. Laterodorsal tegmentum interneuron subtypes oppositely regulate olfactory cue-induced innate fear. Nat Neurosci. 2016 Feb;19(2):283-9.
[5] Wang, L., Chen, I.Z. & Lin, D. Collateral pathways from the ventromedial hypothalamus mediate defensive behaviors. Neuron 85, 1344–1358 (2015).

感谢刘楠提供相关资料

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