狂犬病毒RV

1.  狂犬病毒(RV)简介

狂犬病毒(rabies virus,RV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)。野生型RV是人畜共患的狂犬病的致病因子,在神经系统中具有传播属性,对人和动物均具有较高致病性。
随着反向遗传学手段的成熟,经过改造的RV,可用于神经回路研究。RV感染中枢系统后,主要标记神经元,几乎不标记胶质细胞;被感染的神经元在一定时间内(7-12天)几乎不发生明显病变及裂解。Wickersham 等基于RV疫苗株Sad B-19感染性克隆构建的复制缺陷型重组RV具有较低的毒性和较高的安全性,可清晰的标记神经元的精细形态,并通过反向互补策略实现了对神经网络联接的逆向跨单级突触追踪。

1.1RV的基因组及其编码的蛋白

RV为单股负链RNA病毒,属于弹状病毒科。病毒粒子长约250 nm,直径约为70 nm。病毒基因组长约12kb,由3′端至5′端依次排列着N、P、M、G和L共5个狂犬病毒的结构基因,分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和转录酶大蛋白。

RV 1

图1. RV粒子示意图(图片来自 whelanlab 网站)

1.2RV的生活周期

RV糖蛋白G介导病毒粒子与细胞表面受体结合,通过内吞作用进入细胞。随后通过pH介导膜融合,促使RV基因组释放到细胞质中。感染病毒粒子内包装的L、N、P共同构成的聚合酶复合物以基因组负链RNA为模板启动转录表达,复制,组装,出芽产生子代病毒。

RV 2

图2. 狂犬病毒生命周期示意图(图片来自维基百科)

1.3RV逆行及跨单突触标记特性

RV的囊膜糖蛋白(glycoprotein,G)是其逆行跨突触所必需的蛋白,其受体大量分布在轴突末端,感染后可沿轴突逆行进入神经元胞体开启病毒复制,G蛋白缺失的RV(RV-ΔG)会丧失跨突触能力,而其复制及转录不受影响(可持续高丰度表达外源基因),因此,RV-ΔG携带报告基因后,其功能类似CTB,retrobeads等,可逆向高亮度标记神经元精细形态。另外,补偿RV-G蛋白,可辅助RV-ΔG逆行跨突触感染上一级神经元,从而实现跨单突触神经网络标记。
利用重组的禽类肉瘤病毒(Aviansarcoma-leukosisvirus,ASLV)的外膜蛋白(EnvA)融合蛋白包装RV形成的病毒粒子,可特异性识别EnvA的受体TVA(TVA只存在于禽类细胞中,在哺乳动物神经元中无表达)介导病毒特异性地感染细胞。利用Cre转基因鼠结合Cre-LoxP控制表达TVA及G蛋白的AAV辅助病毒,可实现只在特定区域特异类型神经元中表达TVA及G蛋白,从而利用RV-EnvA-ΔG实现对特异类型神经元的逆向跨单级突触标记(如图3)。

RV 3

图3. A:跨单级RV改造原理; B:RV逆行跨单级突触标记示意图 (Arenkiel BR et al. Nature. 2009.)

2.  RV的制备方法与流程简介

2.1  RV的制备方法

制备过程主要包括病毒拯救、病毒扩增、病毒浓缩以及滴度检测四个部分。

RV 4

图4.RV制备流程示意图(Fumitaka Osakada. Nature Protocols.2013.)

2.2  滴度检测

病毒滴度单位为IFU/ mL(infectious units per mL),表示每毫升病毒能有效感染的靶细胞数目。病毒滴度采用梯度稀释法测定。

RV 5

图5. RV样品制备细胞图(以RV-ΔG-dsred为例)

3.  RV应用实例

3.1 适应的神经科学问题

1) 特定单个区域特异类型神经元的全脑单级输入网络标记。
2) 两个区域特异类型神经元跨单级输入网络标记。
3) 三级连接网络的跨单突触标记。

3.2 应用举例

RV 6

图6. RV-EnvA-ΔG-dsRed结合AAV helper实现神经元跨单突触标记,在两侧海马、丘脑背外侧核(LD)、丘脑前背侧核(AD)、丘脑室旁核(PVA)等脑区都能看到红色荧光蛋白标记的神经元

RV 7

图7. 在嗅球和梨状皮层分别注射RV病毒(双色标记),8天后,两种颜色病毒标记的神经元分布情况(Chapuis et al. J Neurosci. 2013.)

图8.RV--ΔG- EGFP感染效果图

4. 生物安全性

利用RV示踪工具病毒进行相关神经回路标记实验,对实验员的病毒使用经验及生物安全环境有较高要求。动物实验的流程及样本取材实验必须在生物安全二级(BSL-2)实验室中完成,并符合病毒操作相关规程。

5.  RV病毒工具部分产品列表

RVP

参考文献:

[1]Ian R. Wickersham, Heather A. Sullivan & H. Sebastian Seung. Axonal and subcellular labelling using modifiedrabies viral vectors.Nature communications.,Mar,2013. 3332.
[2] Benjamin F. Fosque, Yi Sun, Hod Dana, et al. Labeling of active neural circuits in vivo with designedcalcium integrators. NEURAL CIRCUITS. FEBRUARY 2015. VOL 347 ISSUE 6223.
[3] Ian R. Wickersham1,3 and Heather A. Sullivan. Rabies Viral Vectors for Monosynaptic Tracing and TargetedTransgene Expression in Neurons. CSHprotocol. June ,2015.375-385.
[4] Shinya Ohara, Sho Sato, Kei Oyama, et al. Rabies Virus Vector Transgene Expression Level and Cytotoxicity Improvement Induced by Deletion of Glycoprotein Gene. PLOS ONE.November 2013. Issue 11 ,e80245.

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