水疱性口炎病毒

1.  水泡性口炎病毒(VSV)简介

水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV) 属于弹状病毒科(Rhabdoviridae) 水泡病毒属(Vesiculovirus),是有囊膜的单股负链RNA 病毒。用于顺向跨突触示踪的VSV工具病毒,在大/小鼠动物模型中的神经回路示踪研究中广泛使用。它也能感染多种动物模型,包括鱼类、禽类,及非人灵长类等。其特点是复制及跨突触速度快,外源基因表达量超高,可获得神经元精细形态。

1.1 VSV的基因组及其编码的蛋白

水泡性口炎病毒呈子弹状结构,宽约45一100 nm,长约100一400 nm,是不分节段的单股负链RNA病毒。基因组长约11-12 kb,从3′~5′依次排列着N、P、M、G、L五个不重叠的基因,分别编码核蛋白N、磷蛋白P、基质蛋白M、糖蛋白G以及大聚合酶蛋白L。在N基因3′端有不翻译的47个核苷酸的先导序列(leader),L基因5′端有59个核苷酸的拖尾序列(trailor)。水泡性口炎病毒的基因与基因之间为间隔序列,并且间隔序列都是保守的,每个基因间隔区有病毒聚合酶复合体特异性识别的转录起始序列5′-GAUNNCUGUU-3′(GS)和终止序列5′-UUUUUUCAUA-3′(GE)。

VSV 1

图1. VSV粒子示意图(图片来自 whelanlab 网站)

1.2  VSV的生活周期

VSV糖蛋白G介导病毒粒子与细胞表面受体结合,通过内吞作用进入细胞。随后通过pH介导膜融合,促使VSV基因组释放到细胞质中。感染病毒粒子内包装的L、N、P 共同构成的聚合酶复合物以基因组负链RNA为模板启动转录表达,复制,组装,出芽产生子代病毒。

VSV 2

图2. 水泡性口炎病毒生命周期示意图(图片来自 whelanlab 网站)

1.3 VSV顺行跨突触标记特性

VSV病毒具有特异顺向跨突触的特性。当病毒定位注射到实验区域,病毒感染神经细胞后在神经细胞内复制并表达携带的荧光蛋白基因,子代病毒产生后经轴突运输到突触前,跨突触进入下游神经元,并开始新一轮的复制、包装及跨突触传播等过程。
VSV的囊膜糖蛋白(glycoprotein,G)是其顺向跨突触所必需的蛋白,G蛋白缺失的VSV(VSV-ΔG)会丧失跨突触能力,而其基因组的复制及转录不受影响(可继续高丰度表达外源基因),因此VSV-ΔG病毒可用于快速获得神经元投射分布全貌,同时可用于发展顺行跨单级示踪系统。

VSV 3

图3.VSV特异顺向跨突触传播示意图(Beier KT et al. Frontiers in Neural Circuits. 2013.)

2.  VSV的制备方法与流程简介

2.1  VSV的制备方法

制备过程主要包括病毒拯救、病毒扩增、病毒浓缩以及滴度检测四个部分。 

2.2  滴度检测

病毒滴度单位为IFU/ mL (infectious units per mL),表示每毫升病毒能有效感染的靶细胞数目。病毒滴度采用梯度稀释法测定。

VSV 5

图4. VSV样品制备细胞图(以VSV-GFP为例)

3.  VSV应用实例

3.1 适应的神经科学问题

1) 研究大脑内不同脑区之间的神经信息输出网络结构。例如,顺行追踪感知觉系统信息从外周向中枢输入网络,从低级脑区向高级脑区的信息输出的网络结构;从高级脑区向低级脑区反馈信息输出的网络结构。
2) 神经发育过程中的神经网络变化。
3) 神经精神疾病模型中,大脑中枢及外周信息输出神经网络结构特征和异常变化。
4) 神经损伤及康复模型中,大脑中枢及外周信息输出神经网络的连接状况的损伤程度和恢复程度。

3.2 应用举例

VSV 6

图5. 将VSV-EGFP注射到C57小鼠Spleen区域77 h后灌流取材,在大脑中枢ARC,DMH,PIRI区域检测到荧光信号,表明Spleen将信息传递给了这三个核团

VSV4

图6. rVSV 的顺行或逆行跨多突触案例 (Mundell NA et al. 2015.)
多种类型的神经元被标记,包括谷氨酸能神经元(如皮层锥体神经元,K、O)、GABA 能神经元(中间神经元,C、G)和胆碱能神经元(基底核神经元,L)。DS=dorsal striatum (背侧纹状体), Th=thalamus (丘脑), STN=subthalamic nucleus (丘脑底核), GPe=globus pallidus external segment (苍白球外段), SNr=substantia nigra pars reticulata (黑质网状核), NB=nucleus basalis (基底核)。

4.  生物安全性

利用VSV示踪工具病毒进行相关神经回路标记实验,对实验员的病毒使用经验及生物安全环境有较高要求。动物实验的流程及样本取材实验必须在生物安全二级(BSL-2)实验室中完成,并符合病毒操作相关规程。

5.  VSV的运输和储存

病毒的运输:
病毒采用干冰运输,通常在发出后1-2天送达。

病毒的储存:
1) 4℃短期保存;-80℃长期保存;每冻融一次,病毒滴度降低30%,应避免反复冻融;
2) 病毒于-80℃可长期保存 6个月以上;但如果病毒储存时间超过 6个月,建议在使用前重新测定病毒滴度;
3) 避免细菌、蛋白酶等其他污染。

6.VSV病毒工具部分产品列表

 VSVP

参考文献:

[1] van den Pol AN, Ozduman K, Wollmann G,et al. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J Comp Neurol. 2009 Oct 20;516(6):456-81.
[2] Beier KT, Saunders A, Oldenburg IA,et al. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Sep 13;108(37):15414-9.
[3] Mundell NA, Beier KT, Pan YA,et al.Vesicular stomatitis virus enables gene transfer and transsynaptic tracing in a wide range of organisms.J Comp Neurol. 2015 Aug 1;523(11):1639-63.
[4] Kevin T. Beier, Arpiar B. Saunders, Ian A. Oldenburg,et al. Vesicular stomatitis virus with the rabies virus glycoprotein directs retrograde transsynaptic transport among neurons in vivo. Front. Neural Circuits, 07 February 2013.

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