重组腺相关病毒

1. 腺相关病毒简介

腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV)属于细小病毒科(parvoviridae),单链DNA病毒,经过改造的rAAV病毒工具已被广泛的应用在动物水平的基因表达、基因操作和基因治疗。AAV病毒颗粒无包膜,结构为直径约20 nm的正二十面体,如图1A。1965年,AAV从腺病毒制备物中发现,并由此得名。AAV是迄今发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒,通常需要在辅助病毒(如:腺病毒、单纯疱疹病毒等)的辅助下才能发生产毒性感染,生成子代AAV。

1.1  AAV的基因组及其编码的蛋白

AAV的基因组是长约4.7-6 kb的单链DNA分子,如图1B。基因组的两端都含有约145 bp的反向末端重复序列(ITR),可形成T型的发夹结构,含有DNA复制起始和病毒颗粒包装所需的顺式作用元件。基因组中间含有两个开放阅读框(ORF),从左往右依次为Rep基因和Cap基因。Rep基因编码4个非结构蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40,主要负责病毒基因组的复制,转录调控,位点特异性整合等。Cap 基因编码3个结构蛋白VP1、VP2和VP3,由p40启动子负责转录,构成AAV的衣壳。单个AAV粒子含有60个拷贝的三种结构蛋白(VP1、VP2、VP3 的比例约为1:1:10)。

 AAV 1

图1.A:AAV病毒颗粒示意图;B:AAV病毒基因组结构(Kotterman MA et al. Nat Rev Genet. 2014.)

1.2  AAV的生活史

AAV通过衣壳蛋白与细胞表面的受体结合通过细胞内吞机制进入细胞。AAV被转运进入细胞核后,衣壳蛋白降解释放出单链DNA基因组,然后复制成互补双链DNA,进行基因的转录。AAV的基因组复制、转录、包装都在细胞核内进行。AAV的正链或负链以相同的比例被包装到病毒颗粒中。AAV自身没有裂解细胞的能力,在细胞核中产生的病毒粒子的释放依赖辅助病毒的裂解细胞作用。

1.3  AAV的血清型与其对细胞组织的转导特性

目前,从自然界已经分离出了12种血清型的AAV,从人类细胞中分离的有(AAV2、3、5、6),从非人类动物细胞中分离的有(AAV1、4和7-12),自然界中分离得到的AAV突变型已达100多种。不同血清型AAV的衣壳蛋白识别细胞表面的受体不同,因而对不同组织细胞的侵染效率差异很大,表现出一定的器官靶向特异性。利用这个特点,可以实现特定血清型AAV对特定类型细胞组织特异性的高效转导。通过人工进化的方法对AAV衣壳蛋白Cap基因进行定向突变改造,可以筛选到具有高转导效率和不同感染特性的AAV载体,极大增加了AAV的应用潜力。

AAV 2n

图2. 不同血清型AAV对小鼠组织细胞的嗜性差异很大(Karen Kozarsky et al. Nat Methods. 2010.)

表1.靶向不同的器官及组织推荐使用对应血清型AAV

1.4  重组腺相关病毒载体(rAAV)原理与制备方法简介

重组腺相关病毒载体(rAAV)所包含的DNA一般是用外源基因表达元件替换AAV的编码基因,仅保留了病毒复制和包装所需的ITR序列。通过反式补偿Rep基因、Cap基因和辅助病毒功能因子包装产生的携带外源DNA,如图3A所示。

rAAV具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、能介导基因在动物体内长期稳定表达等特点,是一种重要的携带外源基因病毒工具,被广泛用于生命科学研究,是重要的基因治疗载体之一。2013年,全球首个利用rAAV载体治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物Glybera开始在欧洲出售,患者需要支付昂贵费用,创造了昂贵现代医药的新纪录。截止2016年,基于rAAV的处于临床前和临床阶段研究的药物有162种,基因治疗领域未来对rAAV的需求会越来越大。

传统的制备rAAV的方法,主要是通过单独采用质粒转染、或者质粒转染结合辅助病毒(如腺病毒AdV或单纯疱疹病毒HSV)感染,或者利用辅助病毒感染哺乳动物包装细胞系的方法制备rAAV。但是这些方法,存在产量低、病毒质量不稳定、不适合大规模制备、生产成本高、辅助病毒存在安全风险等缺陷,如图3B所示。

研究数据表明,一次大型灵长类动物试验或临床基因治疗试验就需要约1015 vg (vector genomes)的rAAV,是一般体外细胞试验或小鼠试验用量的成百上千倍。利用三质粒共同转染HEK293细胞,生产1014 vg的rAAV病毒颗粒,就需要转染多达5000 多个175 cm2培养瓶的细胞,这种传统方法制备rAAV 显然无法满足大规模试验的需求。虽然,目前已经建立了一些大规模制备rAAV 的方法,但仍然存在灵活性差、通用性低、病毒产量低、生产成本高等缺点。

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图3. A:rAAV载体原理(Kotterman MA et al. Nat Rev Genet. 2014.);B:制备rAAV的三质粒系统示意图(Ayuso E et al. Curr Gene Ther. 2010.)

1.5  杆状病毒系统制备rAAV方法的优势

杆状病毒系统被广泛应用于重组蛋白的表达、疫苗制备、病毒样颗粒的包装等,通过无血清培养基大规模悬浮发酵培养,能够满足大规模工业化制备的要求。杆状病毒专一性感染昆虫而不感染哺乳动物,对人没有致病性,安全性高。研究表明利用杆状病毒系统制备的rAAV在物理性质,生物活性,转导特性上与哺乳动物细胞制备的rAAV相似。国际上首例rAAV基因治疗药物Glybera就是采用了杆状病毒表达系统的生产工艺,充分证明了杆状病毒系统制备rAAV方法的优势。

2.  rAAV新系统制备方法与流程简介

本公司采用的是新型杆状病毒系统制备rAAV的方法。该系统可通过穿梭载体灵活装载外源基因的片段,并在细菌内高效重组到杆状病毒基因组上。再将抽提出的重组杆状病毒基因组DNA经转染Sf9昆虫细胞,产生有感染活性的重组杆状病毒。然后,利用重组杆状病毒(BEV)感染悬浮培养的Sf9细胞生产rAAV,如图4所示。新型杆状病毒系统灵活性高、通用性强、病毒质量高、产量高,适于大规模放大生产,rAAV纯化后能够达到很高的纯度,生物安全性高。

AAV 4

图4.杆状病毒系统制备rAAV的流程图

2.1  rAAV的纯化方法

 目前,rAAV的纯化主要有超速密度梯度离心法,使用离心介质是氯化铯(CsCl)和碘克沙醇(iodixanol);化学试剂沉淀抽提法,主要用到PEG、硫酸铵、氯仿等;层析纯化法,主要利用亲和、离子交换等。根据客户不同的使用需求,我们能够综合应用多种方法制备出高滴度,高纯度,高质量的rAAV病毒产品。

2.2  rAAV的质检

2.2.1  滴度检测

rAAV的滴度是通过定量PCR的方法检测rAAV基因组的拷贝数的方法,滴度单位是 vg/mL。病毒滴度用Q-PCR来测量,下图为rAAV-GFP病毒产品的滴度测量结果。

AAV 5

图5.通过Q-PCR检测,rAAV-GFP的滴度为1012 vg/mL 

2.2.2  纯度检测

rAAV的纯度检测是采用蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)检测rAAV核衣壳蛋白含量的方法,一般用百分比(%)表示。AAV的外壳有VP1VP2VP3三个蛋白组成,大小分别是87 KD73 KD62 KDSDS-PAGE胶图中会出现三条带。我们保证提供给客户的数据、材料真实可靠。

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图6.SDS-PAGE检测rAAV纯度达97%以上

3.  rAAV应用实例及现有产品分类

3.1  广谱及特异表达

基于启动子的选择(表3),利用AAV病毒载体可实现广泛表达,也可实现部分细胞类型的特异性侵染;基于Cre或Flp系统,利用AAV搭载DIO或FDIO可高精度靶向特异类型神经元或者细胞;同时利用Cre或Flp系统结合,可选择性靶向特定类型神经元的亚类细胞,不同组织脏器的亚类细胞,并进行结构与功能研究,在不远的未来用于基因治疗。

表2. rAAV载体克隆可选择的启动子

 

3.2 应用案例

3.2.1视网膜内界膜细胞的感染

AAV 7

图7.在内界膜注射 rAAV2-CBA-GFP,病毒感染效果图。A:在注射部位,大部分的视网膜神经细胞病毒表达水平都很高 ;B: 视网膜muller细胞和双极细胞均检测到信号(Boye SE et al. Hum Gene Ther. 2016)

3.2.2 AAV在肝脏纤维化研究中的应用

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图8.rAAVX-EYFP感染肌成纤维细胞效果图(Rezvani M et al. Cell Stem Cell. 2016.)

3.2.3脑中枢神经元的感染

AAV 9a 

图9. rAAV-mcherry注射海马感染效果图

3.2.4神经元投射研究 

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图10.rAAV-dio-EFYP注射腹侧海马VHPC感染效果图,注射位点表达很强且在 fi,LH等区域也检测到荧光信号。

3.2.5心脏心肌细胞的感染

AAV 11

图11. 不同血清型不同滴度的rAAV病毒感染心肌细胞(Prasad KM et al. Gene Therapy. 2011.)
实验方案:所用动物为一周龄C57BL/6小鼠,体重22.0-2.5 g。注射前动物用1-1.2%异氟烷麻醉,之后向颈静脉注入病毒。

3.2.6骨骼肌细胞感染

AAV 12

图12.AAV-lacZ注射肌细胞,原位杂交检测病毒的表达量(Kessler PD et al. PNAS. 1996.)
感染小鼠骨骼肌细胞:8周龄雄性小鼠经甲氧氟烷麻醉,在胫前肌中部位置打开1 cm切口,经注射器通过玻璃针头注入病毒。

3.2.7肺部细胞的感染

AAV 13

图13.在CMV和RSV启动子调控下AP在肺部的表达情况(Halbert CL et al. Hum Gene Ther. 2007.)
小鼠呼吸系统的感染:将rAAV病毒稀释到50-75 L的HBSS中。用2.5%异氟烷麻醉小鼠,将小鼠平躺使它鼻子向上,将滴管的开口紧靠小鼠的鼻孔。病毒溶液自然在滴管口形成液滴并自动被小鼠吸入。整个过程不要超过5秒钟。

3.2.8  神经示踪

利用AAV病毒载体(搭载DIO或FDIO)结合我们的嗜神经病毒HSV/RV/PRV/VSV等标记系统可以精确获得中枢及外周神经系统特定区域或特定类型神经元多级输出网络、输入网络及单级输入或输出网络。

AAV 14

图14.图a.利用狂犬病毒系统逆向追踪小鼠背外侧被盖区(LDT)中PV阳性和SOM阳性中间神经元的直接调控网络示意图;图b. LDT中PV阳性和SOM阳性中间神经元都接受来自外侧僵核(LHb)的直接调控(Yang H et al. Nat Neurosci. 2016.)

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图15.利用AAV和狂犬病毒RV逆向跨单突触系统研究杏仁核基底外侧核后部至腹侧海马CA1区之间存在丰富的谷氨酸能兴奋性单突触输入(Yang Y et al. Nat Commun. 2016.)

3.2.9  神经元活动监测及操控

利用AAV病毒载体表达神经元活动监测的探针,如Gcamp6等,结合相关技术,可监测动物在不同活动或刺激状态下特定脑区神经元总体及其在单细胞水平的响应情况;通过AAV病毒在神经元表达光敏感离子通道蛋白,如ChR2、eNPHR等,可实现特异性兴奋及抑制神经元,监测其对清醒状态下动物行为的影响;利用AAV病毒在神经元表达DREADDs,也可实现长时程激活或抑制神经元。利用AAV搭载c-fos/arc等神经元活动依赖的启动子,可特异靶向与动物某种行为相关的神经元。

3.2.10  基因操作(适用于各种组织、器官等)

利用AAV病毒载体也可实现在体基因RNAi及过表达,搭载CRISPR-Cas9系统后可精确实现在体基因编辑,包括单基因、多基因敲除与过表达;另外利用AAV搭载四环素调控元件,可以在时间上精确控制基因表达。

4.  病毒载体选择指南

面对基因治疗常用的三种病毒,如何做出正确选择?在选择AAV之前,你可能会考虑以下几个问题。
1. 需要基因短暂表达还是长期稳定表达?
2. 需要感染分裂细胞还是非分裂细胞?
3. 靶细胞的免疫原性如何?
4. 所需插入外源基因多大?
AAV对分裂细胞和非分裂细胞均有感染能力。感染细胞温和,免疫原性低,转染效率高,在非分裂细胞中长期稳定表达,在分裂细胞中短期表达。但是AAV载体包装能力有限,两端ITR之间只有4.9 kb,所以插入外源基因大小应≤3.5 kb。(AAV包装能力只有3 kb左右,枢密科技对AAV载体进行优化,使其包装能力达到4.9 kb)您可以参照下表选择合适的病毒载体。

表6.病毒载体参照指南

AAV E3

5.  生物安全性

重组腺相关病毒和慢病毒一样都是复制缺陷的假病毒载体,安全无害。使用条件符合在常规BSL-1实验室操作。

参考文献:

[1] Rajendran S1, Collins S, van Pijkeren JP Targeting of breast metastases using a viral gene vector with tumour-selective transcription. Anticancer Res. 2011 May;31(5):1627-35.
[2] Yang Y, Wang L, Bell P, McMenamin D,et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 2016 Mar;34(3):334-8.
[3] Cunningham SC1, Spinoulas A, Carpenter KH,et al. AAV2/8-mediated correction of OTC deficiency is robust in adult but not neonatal Spf(ash) mice. Mol Ther. 2009 Aug;17(8):1340-6.
[4] Zhang X1, Guo W1, Wang X,et al. Antitumor activity and inhibitory effects on cancer stem cell-like properties of Adeno-associated virus (AAV) -mediated Bmi-1 interference driven by Bmi-1 promoter for gastric cancer. Oncotarget. 2016 Mar 18.
[5] Muzerelle A1,2,3, Scotto-Lomassese S1,2,3, Bernard JF,et al. Conditional anterograde tracing reveals distinct targeting of individual serotonin cell groups (B5-B9) to the forebrain and brainstem. Brain Struct Funct. 2016 Jan;221(1):535-61.
[6] Economo MN, Clack NG, Lavis LD,et al. A platform for brain-wide imaging and reconstruction of individual neurons. Elife. 2016 Jan 20;5:e10566.
[7] Bráz JM, Wang F, Basbaum AI. Presynaptic Inputs to Any CNS Projection Neuron Identified by Dual Recombinant Virus Infection. PLoS One. 2015 Oct 15;10(10):e0140681.
[8] Wei P, Liu N, Zhang Z, Liu X,et al. Processing of visually evoked innate fear by a non-canonical thalamic pathway. Nat Commun. 2015 Apr 9;6:6756.
[9] Yang H, Yang J, Xi W, Hao S, Luo B, He X,et al. Laterodorsal tegmentum interneuron subtypes oppositely regulate olfactory cue-induced innate fear. Nat Neurosci. 2016 Feb;19(2):283-9.

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