基因编辑服务之一:CRISPR/Cas9基因敲除

简介

CRISPR/CasClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas)系统是目前被广泛运用的基因编辑系统,其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列,对序列进行切割。其中最常用的是靶向DNACRISPR/Cas9系统,此系统是由IICRISPR/Cas系统改造而来,能够在植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物等多种细胞中,进行有效的靶向编辑,具有操作简易、效率高、以及作用靶位点多等优势。

CRISPR/Cas9系统中sgRNA(small guide RNA)识别并结合目标基因的靶向序列,引导Cas9对结合位点进行剪切,产生DNA双链断裂(double-strand break, DSB),机体自身通过非同源重组(non-homologous end joiningNHEJ)的方式修复DSB,参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基,修复后的基因由于产生突变而导致功能丧失,从而实现机体内的基因敲除(Gene Knockout)。

其中Cas9可根据不同菌属来源及大小进行分类,目前得到广泛应用的有SpCas9SaCas9SpCas9来源于化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9核酸酶,由1368个氨基酸组成,可识别的PAM序列为NGG ,由于构建载体载量过大,因此所选择的病毒载体有限,通常构建在慢病毒载体上;SaCas9是来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9核酸酶,由1053个氨基酸组成,可识别的PAM序列为NNGRRT,比SpCas925%,能够进行AAV病毒的包装,适用范围更广。

CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑(Wiles M V et al. Mammalian Genome, 2015


非同源重组修复DSBWiles M V et al. Mammalian Genome, 2015

应用

CRISPR/Cas9基因敲除细胞系建立

CRISPR/Cas9基因敲除建立动物疾病模型

技术优势

  1. 操作简易:仅需Cas9核酸酶和sgRNA即可对目标基因靶位点进行切割;
  2. 效率高:在基因组水平上编辑目标基因,高度模拟目标模型,可精确编辑基因组;
  3. 作用靶位点多:可实现多个靶基因位点及多个基因的同时敲除;
  4. 提供多种基因编辑病毒工具:AAVLV
  5. 提供 BSL-1 BSL-2 病毒注射及实验操作平台;
  6. 全面的实验技术支持。

服务内容

  1. sgRNA的设计;
  2. 细胞内sgRNA剪切活性筛选;
  3. 敲除载体的构建
  4. 依据所要编辑的细胞选择Cas9sgRNA不同导入方式

a、脂质体易转染细胞:使用质粒系统(Cas9sgRNA

b、 脂质体难转染细胞:使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染(Cas9sgRNA

5.筛选基因敲除单克隆细胞系

服务流程

客户提供

1、目的基因基因序列(序列/ID)以及物种来源

2、需介导基因敲除的细胞(可选)

3、病毒类型选择以及要求

4、血清型选择

 

服务信息及最终交付内容、产品

流程分布 周期(工作日) 交付内容 交付产品
sgRNA序列的设计 2~4 sgRNA设计分析报告

sgRNA的活性筛选 获得有活性的sgRNA及筛选报告
基因敲除质粒的构建 1 基因敲除质粒报告
病毒包装 3 病毒包装报告 高纯度病毒
单克隆细胞分选报告 8 单克隆细胞分选及检测结果报告 基因敲除单克隆细胞系

声明:枢密科技提供的所有基因编辑服务及该服务的后续研究仅适用在国家法律和伦理规范的范围内实施。禁止用于任何人体或临床实验的研究禁止用于对人类生殖体系进行基因修饰的研究禁止基因修饰的其他动物胚胎及生殖细胞植入人体客户如违反相关法律规定,本公司不承担任何法律责任。

 

案例展示

HaoyiWang等人研究发现,CRISPR / Cas介导的基因编辑允许高效地同时破坏小鼠胚胎干(ES)细胞中的五个基因(Tet123SryUty-8等位基因),通过NHEJ引入多个随机indel的靶向突变。将靶向Tet1Tet2Cas9 mRNAsgRNA共注射到受精卵中,在两种基因中产生具有双等位基因突变的小鼠,效率为80%。CRISPR / Cas系统允许一步产生携带多个基因突变的动物,这种方法将大大加速功能冗余基因和上位基因相互作用的体内研究。

小鼠胚胎干细胞的多基因敲除Wang H et al. Cell, 2013

    

小鼠和小鼠胚胎干细胞的多基因编辑(Wang H et al. Cell, 2013

参考文献

  1. Wiles M V , Qin W , Cheng A W , et al. CRISPR–Cas9-mediated genome editing and guide RNA design[J]. Mammalian Genome, 2015, 26(9-10).
  2. Wang H , Yang H , Shivalila C , et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering[J]. Cell, 2013, 153(4):910-918.

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