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[AAV滴度] 活体注射需回避滴度虚高!

不同的实验,对病毒注射滴度要求有差异。虚高的病毒滴度以及普遍的可能超出实验需求的高滴度注射,已经给一些实验的开展带来困扰。病毒的真实滴度是开展后续实验的关键参数,下文以AAV相关实验列举与此相关的两个问题:1)病毒滴度的检测;2)实验中病毒注射滴度的确定。

1. 滴度检测:

1)枢密采用的定量工艺,已极大程度避免了使用ITR定量产生的虚高滴度,能够较好地反映真实的病毒量。虚高的病毒滴度会导致实验难以开展,无法观察到实验现象,不能够重复。
2)AAV的滴度,给出的结果是检测到的基因组拷贝数,反映的是病毒颗粒数,单位是vg/mL,即vector genomes/mL。

2. 病毒注射:

1)    病毒注射前调整至合适的工作浓度。
2)  AAV中枢注射?
答:注射体积与核团的大小有关,一般在200-300 nL,滴度在10^12 数量级即可。用量根据随基因片段大小,启动子活性高低,表达丰度而适当调整。对大核团的侵染,则需要考虑多位点注射及大体积注射。
3) AAV外周注射?
答:请根据实验查阅文献或就产品咨询我们的销售和技术支持。
4) AAV感染小鼠后多久可以观察结果?
答:一般,2-3周可检测到较强的信号表达(胞体和纤维均可见)。部分产品,在7-14天就能观察到很好的表达。
5) AAV外源基因表达时长?
答:6个月以上,在小鼠大脑中可持续两年以上。活体组织中外源基因的表达量和表达曲线,受到具体实验条件,小鼠免疫清除强度,细胞增殖特性,病毒携载基因特性等多个因素影响。

3. 哪些实验需要高滴度注射:

1)小鼠和大鼠的病毒使用:一般,建议将注射滴度控制在≤ 5 x 10^12 vg/mL范围。
2)非人灵长类使用:对于此类动物的注射,需要注射高滴度,10^13 vg/mL数量级的病毒。
3)特定类别的病毒产品:如rAAV/Retro系列、1 型AAV顺跨单系列。这两类AAV均需要高滴度注射。我们的实验发现,这两类病毒能够携载的功能探针和基因有各自的适用范围,可咨询我们的销售和技术支持。