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助力科研---高纯度滴度病毒开启非人灵长类科研之路

导读:

非人灵长类(Nonhuman Primate,NHP)动物是研究脑的结构与功能、各种脑疾病的病理及治疗的主要模型之一。特别是在理解人类所具有的感觉、运动和高级认知功能的神经机制方面,有着不可替代的作用。其脑结构和功能的解析也是中国脑科学计划的焦点。现阶段,病毒载体在NHP脑结构和功能解析中扮演者非常重要的作用。如利用病毒做神经环路示踪、光遗传、钙成像、药理学、磁遗传学研究,也可以进行基因编辑、干扰、过表达等。NHP具有较强免疫能力,给病毒工具的应用带来了挑战。只有保证病毒具有高纯度和高滴度,才能实现较好的效果。

枢密科技提供包括光遗传学,药理学,钙成像,基因编辑,基因治疗在内的一系列满足灵长类注射的高滴度高纯度病毒工具。

正文

一直以来,非人灵长类动物被认为是与人类脑功能结构最接近的物种,可用于研究在灵长类所特有的脑结构和功能及演化机制,是解析人类高级认知功能的神经环路结构和工作原理、进行脑重大疾病的机理和诊断干预手段的研发,甚至宏观脑图谱绘制非常必要的实验模型。

病毒工具推动灵长类研究的多样化开展

各种脑科学技术的不断革新和涌现为脑科学研究带来更发展前景。包括基因编辑及干细胞技术、遗传学标记与神经环路示踪技术、透明脑与快速光学成像、fMOST及单细胞转录组技术等。其中,以CRISPR/Cas 9为代表的新基因编辑工具,使得NHP动物的遗传操作愈加容易。新的转基因NHP动物和灵长类脑疾病模型不断涌现。而实现精确的基因修饰,较为依赖于转基因动物操作平台,Knock-in/Knock-out的效率及周期仍然限制NHP动物在更多实验室的应用。基于各类病毒工具发展的编辑及示踪技术,能够在出生后的各个阶段,研究生理及病理状态下。在体操作NHP动物,从分子到细胞,从环路到行为,解析基因-表型关联,探索脑疾病的致病机制,并在此基础上寻求新的有效的治疗策略。

何时使用NHP模型 [Ref 1]
NHP与啮齿类的大脑在生理物理结构(脑容量,细胞类型和细胞数目),基因表达及功能行使都存在差异,在进行如下研究时应考虑使用NHP模型。

1. 研究高级认知功能:由前额叶控制的高级认知功能相关的临床症状,致病基因在NHP和啮齿类动物的表达有差异,在啮齿类动物上难以模型等同化;
2. 研究社会行为学:尤其是精神类疾病,NHP和啮齿类的行为表现差异很大。与精神疾病风险发生相关的遗传变异,如细胞特异性启动子、增强子、内含子、非编码RNA也是显著不同的;调节行为的物质,如神经肽催产素仍需要在NHP动物中进行详尽的评估;
3. 研究CNS疾病相关的药物:包括发育相关,神经性的和精神疾病。以神经肽催产素和α-7烟碱型乙酰胆碱受体为例,其在啮齿类和NHP中分布是不同的。经啮齿类动物测试有效的药物在临床试验的效果常不尽如人意。临床前增加NHP实验有助于降低临床试验的风险;
4. 研究发育及前驱症状相关的疾病:人的大脑发育比啮齿类动物慢得多,经历相当长的幼龄阶段,这一时期的经验学习急剧地塑造脑部的结构和功能,NHP模型显然是更接近人类的。

人类疾病NHP模型 [Ref 1]
在NHP动物里再现人的疾病,对某个基因操作之前,应对基因-表型关联和致病机制有所预期,即现有的技术能够在何种程度上实现模型的构建,相应的疾病表型如何判断,如何保证重复性?

1. 易造模疾病:单个等位基因突变即有致病表型,如单倍剂量不足(Shank3和自闭症),或者是X染色体连锁的(FMRP、MECP2、DMD)。这些靶点的另一个显著特征则是病人有早期发育缺陷,可在较早阶段观察NHP遗传模型。
2. 难成模疾病:功能获得性突变和部分功能缺失的突变不容易操作,多数需要基因敲入,通过同源重组精确改变基因内部序列。典型的例子包括亨廷顿症,肌萎缩性脊髓侧索硬化症,阿尔茨海默症。
3. 多基因疾病模型:此类疾病的发生涉及到多个基因,单个基因的影响及表型并不十分显著,表现出遗传学和临床异质性。如常见的精神分裂症和双相障碍,因其影响的是认知功能,难以在啮齿类动物上造模。此类疾病的模型化在技术上面临挑战。

小结

研究人员越来越多将注意力转向NHP转基因动物和疾病模型的开发上。与此同时,国际上针对动物福利的法规也越来越严苛。因此,不同机构多方合作开展NHP实验克服技术瓶颈,尽可能充分地利用非人灵长类动物资源,助力人类脑疾病研究。

 

病毒测试效果图

Figure 1. Expression of rAAV-CamkII-mCherry-WPRE-pA. 注射位点:额叶(弓状沟后方,FEF区);滴度:(1E+13 vg/ml)。

Figure 2. Expression of rAAV-hSyn-mCherry-WPRE-pA.  注射位点:视皮层(V1);滴度:(2E+12 vg/ml)。

结论:

由上图可知,注射的病毒由注射位点感染,进入胞体后沿轴突运输到特定区域。结果表明,病毒均匀分布于所标记的脑区,同时,病毒携带的外源基因可以在靶细胞内高效表达。AAV9可通过皮层-纹状体途径进行双向运输,在神经系统性疾病如阿尔茨海默症和亨廷顿症等的基因治疗中显示着巨大的应用前景[Ref 2]

References
[1] Nat Neurosci. 2016 Aug 26;19(9):1123-30. doi: 10.1038/nn.4362.Opportunities and challenges in modeling human brain disorders in transgenic primates.
[2] Gene Ther. 2016 Jun;23(6):520-6. doi: 10.1038/gt.2016.24. Axonal transport of AAV9 in nonhuman primate brain.